1. প্রাথমিক বোঝাপড়া

এই পর্যায়ে, আমাদের কিছু ধারণা এবং পরিভাষা বুঝতে হবে, যাতে আমাদের সিনিয়রদের সামনে ভুল করা এড়ানো যায়, যেমন:

প্রশ্ন: আরটি-পিসিআর, কিউপিসিআর, রিয়েল-টাইম পিসিআর এবং রিয়েল-টাইম আরটি-পিসিআর-এর মধ্যে পার্থক্য কী?

উত্তর: RT-PCR হল রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন PCR(রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন পিসিআর, আরটি-পিসিআর), যা পলিমারেজ চেইন রিঅ্যাকশন (পিসিআর) এর একটি বহুল ব্যবহৃত রূপ।আরটি-পিসিআর-এ, একটি আরএনএ স্ট্র্যান্ড বিপরীতভাবে পরিপূরক ডিএনএ-তে প্রতিলিপি করা হয়, যা পিসিআর দ্বারা ডিএনএ পরিবর্ধনের জন্য একটি টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহৃত হয়।
রিয়েল-টাইম-পিসিআর এবং কিউপিসিআর(কোয়ান্টিটেটিভ রিএ-লিটাইম-পিসিআর) একই জিনিস, উভয়ই রিয়েল-টাইম কোয়ান্টিটেটিভ পিসিআর, যার মানে হল যে পিসিআর-এর প্রতিটি চক্রের রিয়েল-টাইম ডেটা রেকর্ড রয়েছে, তাই প্রারম্ভিক টেমপ্লেটের সংখ্যা সুনির্দিষ্ট বিশ্লেষণে সামঞ্জস্য করা যেতে পারে।

যদিও রিয়েল-টাইম পিসিআর (রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্ট কোয়ান্টিটেটিভ পিসিআর) এবং রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন পিসিআর (রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন পিসিআর) সংক্ষেপে আরটি-পিসিআর বলে মনে হয়, আন্তর্জাতিক নিয়ম হল: আরটি-পিসিআর বিশেষভাবে বিপরীত প্রতিলিপিকে বোঝায়।পিসিআর, রিয়েল-টাইম পিসিআর সাধারণত কিউপিসিআর (পরিমাণগত রিয়েল-টাইম পিসিআর) হিসাবে সংক্ষিপ্ত হয়.

এবং রিয়েল-টাইম RT-PCR (RT-qPCR), এটি ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত প্রযুক্তির সাথে মিলিত বিপরীত প্রতিলিপি পিসিআর: প্রথমে RNA রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন থেকে cDNA (RT) প্রাপ্ত করুন এবং তারপর পরিমাণগত বিশ্লেষণের জন্য রিয়েল-টাইম PCR ব্যবহার করুন (qPCR)।বেশিরভাগ ল্যাবরেটরি RT-qPCR করে, অর্থাৎ RNA এক্সপ্রেশন ডাউন-রেগুলেশন নিয়ে গবেষণা করে, তাই ল্যাবরেটরিতে সবাই যে qPCR নিয়ে কথা বলে তা আসলে RT-qPCR-কে বোঝায়, কিন্তু ভুলে যাবেন না যে ক্লিনিকাল অ্যাপ্লিকেশনগুলিতে এখনও অনেক DNA পরীক্ষা আছে।পরিমাণগত বিশ্লেষণ, যেমন হেপাটাইটিস বি ভাইরাস এইচবিভি সনাক্তকরণ।

প্রশ্ন: প্রচুর ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর পড়ার পরে, কেন পরিবর্ধিত খণ্ডটি 80-300bp এর সীমার মধ্যে নিয়ন্ত্রণ করা উচিত?

উত্তর: প্রতিটি জিন সিকোয়েন্সের দৈর্ঘ্য ভিন্ন, কিছু কয়েক kb, কিছু শত শত bp, কিন্তু প্রাইমার ডিজাইন করার সময় আমাদের শুধুমাত্র পণ্যের দৈর্ঘ্য 80-300bp হতে হবে, খুব ছোট বা খুব দীর্ঘ ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত PCR সনাক্তকরণের জন্য উপযুক্ত নয়।পণ্যের খণ্ডটি প্রাইমার-ডাইমার থেকে আলাদা করার জন্য খুব ছোট।প্রাইমার-ডাইমারের দৈর্ঘ্য প্রায় 30-40bp, এবং এটি একটি প্রাইমার-ডাইমার নাকি একটি পণ্য যদি এটি 80bp-এর কম হয় তা পার্থক্য করা কঠিন।যদি পণ্যের খণ্ডটি খুব দীর্ঘ হয়, 300bp অতিক্রম করে, এটি সহজেই কম পরিবর্ধন দক্ষতার দিকে পরিচালিত করবে এবং কার্যকরভাবে জিনের পরিমাণ সনাক্ত করতে পারবে না।

উদাহরণস্বরূপ, আপনি যখন একটি শ্রেণীকক্ষে কতজন লোক আছে তা গণনা করার সময়, আপনাকে শুধুমাত্র কতগুলি মুখ আছে তা গণনা করতে হবে।একই কথা সত্য যখন আপনি জিন সনাক্ত করেন, আপনাকে শুধুমাত্র একটি জিনের একটি নির্দিষ্ট ক্রম সনাক্ত করতে হবে যা সমগ্র ক্রমটি করবে।আপনি যদি লোক গণনা করতে চান তবে আপনাকে মুখ এবং নাক, কান এবং চশমা উভয়ই গণনা করতে হবে এবং ভুল করা সহজ।

বিস্তৃত করার জন্য, জৈবিক গবেষণায়, বিন্দু থেকে অঞ্চলে অনেক গবেষণার ঘটনা রয়েছে, কারণ যে কোনও প্রজাতির জিনের ক্রমটি খুব দীর্ঘ, সমস্ত খণ্ডকে পরিমাপ করা অপ্রয়োজনীয় এবং অসম্ভব, যেমন ব্যাকটেরিয়া 16S সিকোয়েন্সিং, যা ব্যাকটেরিয়ার রক্ষণশীল ক্রমটি পরিচালনা করে একটি নির্দিষ্ট জনসংখ্যার সংখ্যা নির্ণয় করতে।

প্রশ্ন: qPCR প্রাইমার ডিজাইনের জন্য সর্বোত্তম দৈর্ঘ্য কত?

উত্তর: সাধারণভাবে বলতে গেলে, প্রাইমারের দৈর্ঘ্য প্রায় 20-24bp, যা ভালো।অবশ্যই, প্রাইমার ডিজাইন করার সময় আমাদের অবশ্যই প্রাইমারের টিএম মানের দিকে মনোযোগ দিতে হবে, কারণ এটি সর্বোত্তম অ্যানিলিং তাপমাত্রার সাথে সম্পর্কিত।অনেক পরীক্ষা-নিরীক্ষার পর এটা প্রমাণিত হয়েছে যে 60°C হল একটি ভালো TM মান।অ্যানিলিং তাপমাত্রা খুব কম হলে, এটি সহজেই অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনের দিকে পরিচালিত করবে।অ্যানিলিং তাপমাত্রা খুব বেশি হলে, পরিবর্ধনের দক্ষতা তুলনামূলকভাবে কম হবে, পরিবর্ধন বক্ররেখার শিখর পরে শুরু হবে এবং সিটি মান বিলম্বিত হবে।

প্রশ্ন: ডাই পদ্ধতিটি প্রোব পদ্ধতি থেকে কীভাবে আলাদা?

উত্তরঃ ডাই পদ্ধতিকিছু ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জক, যেমন SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ইত্যাদি, নিজের দ্বারা আলো নির্গত করে না, কিন্তু দ্বি-অবস্থিত DNA-এর ক্ষুদ্র খাঁজের সাথে আবদ্ধ হওয়ার পরে ফ্লুরোসেন্স নির্গত করবে।অতএব, পিসিআর প্রতিক্রিয়ার শুরুতে, মেশিনটি ফ্লুরোসেন্ট সংকেত সনাক্ত করতে পারে না।প্রতিক্রিয়া যখন অ্যানিলিং-এক্সটেনশন পর্যায়ে পৌঁছায়, তখন ডাবল স্ট্র্যান্ড খোলা হয় এবং ডিএনএ পলিমারেজের ক্রিয়ায় একটি নতুন স্ট্র্যান্ড সংশ্লেষিত হয় এবং ফ্লুরোসেন্ট অণুটি dsDNA ছোট খাঁজের সাথে আবদ্ধ হয়।পিসিআর চক্রের সংখ্যা বাড়ার সাথে সাথে আরও বেশি রঞ্জক ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ-এর সাথে মিলিত হয় এবং ফ্লুরোসেন্ট সংকেতও ক্রমাগত উন্নত হয়।ডাই পদ্ধতিটি মূলত বৈজ্ঞানিক গবেষণায় ব্যবহৃত হয়।
PS: পরীক্ষা করার সময় সতর্কতা অবলম্বন করুন, রঞ্জকটিকে মানুষের ডিএনএর সাথে একত্রিত করতে হবে, এটিকে ফ্লুরোসেন্ট ব্যক্তিতে পরিণত করতে সতর্ক থাকুন।

ডাই পদ্ধতি (বাম) প্রোব পদ্ধতি (ডান)
PS: পরীক্ষা করার সময় সতর্কতা অবলম্বন করুন, রঞ্জকটিকে মানুষের ডিএনএর সাথে একত্রিত করতে হবে, এটিকে ফ্লুরোসেন্ট ব্যক্তিতে পরিণত করতে সতর্ক থাকুন।

SYBR সবুজ Ⅰ DNA এর ছোট খাঁজের সাথে আবদ্ধ

অনুসন্ধান পদ্ধতিতাকমান প্রোব হল সবচেয়ে বেশি ব্যবহৃত হাইড্রোলাইসিস প্রোব।প্রোবের 5′ প্রান্তে একটি ফ্লুরোসেন্ট গ্রুপ রয়েছে, সাধারণত FAM, এবং প্রোব নিজেই লক্ষ্য জিনের পরিপূরক একটি ক্রম।3′ প্রান্তে একটি ফ্লুরোসেন্ট quenching গ্রুপ আছে।ফ্লুরোসেন্স রেজোন্যান্স এনার্জি ট্রান্সফারের নীতি অনুসারে (Förster resonance energy transfer, FRET), যখন রিপোর্টার ফ্লুরোসেন্ট গ্রুপ (দাতা ফ্লুরোসেন্ট অণু) এবং quenching ফ্লুরোসেন্ট গ্রুপ (গ্রহণকারী ফ্লুরোসেন্ট অণু) উত্তেজিত হয়, যখন স্পেকট্রা ওভারল্যাপ হয় এবং দূরত্ব খুব কাছাকাছি হতে পারে (100 মিটার দূরত্ব) গ্রহণকারী অণুর ফ্লুরোসেন্স, যখন অটোফ্লুরেসেন্স দুর্বল হয়।অতএব, পিসিআর প্রতিক্রিয়ার শুরুতে, যখন প্রোবটি সিস্টেমে বিনামূল্যে এবং অক্ষত থাকে, তখন রিপোর্টার ফ্লুরোসেন্ট গ্রুপ ফ্লুরোসেন্স নির্গত করবে না।অ্যানিলিং করার সময়, প্রাইমার এবং প্রোব টেমপ্লেটের সাথে আবদ্ধ হয়।এক্সটেনশন পর্যায়ে, পলিমারেজ ক্রমাগত নতুন চেইন সংশ্লেষিত করে।ডিএনএ পলিমারেজের 5′-3′ এক্সোনিউক্লিজ কার্যকলাপ রয়েছে।প্রোবের কাছে পৌঁছানোর সময়, ডিএনএ পলিমারেজ টেমপ্লেট থেকে প্রোবটিকে হাইড্রোলাইজ করবে, প্রতিবেদক ফ্লুরোসেন্ট গ্রুপকে quencher ফ্লুরোসেন্ট গ্রুপ থেকে আলাদা করবে এবং ফ্লুরোসেন্ট সংকেত প্রকাশ করবে।যেহেতু প্রোব এবং টেমপ্লেটের মধ্যে এক-এক সম্পর্ক রয়েছে, তাই পরীক্ষার নির্ভুলতা এবং সংবেদনশীলতার দিক থেকে প্রোব পদ্ধতিটি ডাই পদ্ধতির চেয়ে উচ্চতর।প্রোব পদ্ধতিটি প্রধানত রোগ নির্ণয়ে ব্যবহৃত হয়।

প্রশ্নঃ পরম পরিমাপ কি?আপেক্ষিক পরিমাপ কি?

উত্তর: পরম পরিমাণ নির্ধারণ বলতে qPCR দ্বারা পরীক্ষা করা নমুনার প্রাথমিক কপি নম্বরের গণনাকে বোঝায়, যেমন 1ml রক্তে কতগুলি HBV ভাইরাস রয়েছে।আপেক্ষিক পরিমাপ দ্বারা প্রাপ্ত ফলাফল হল অন্য রেফারেন্স নমুনার তুলনায় একটি নির্দিষ্ট নমুনায় লক্ষ্য জিনের পরিমাণের পরিবর্তন এবং জিনের অভিব্যক্তি আপ-নিয়ন্ত্রিত বা নিম্ন-নিয়ন্ত্রিত।

প্রশ্ন: আরএনএ নিষ্কাশনের পরিমাণ, বিপরীত প্রতিলিপি দক্ষতা এবং পরিবর্ধন দক্ষতা পরীক্ষামূলক ফলাফলগুলিকে প্রভাবিত করবে?
প্রশ্ন: নমুনা স্টোরেজ, নিষ্কাশন বিকারক, বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন বিকারক, এবং হালকা-প্রেরণকারী ভোগ্য সামগ্রী পরীক্ষামূলক ফলাফলগুলিকে প্রভাবিত করবে?
প্রশ্নঃ কোন পদ্ধতি পরীক্ষামূলক তথ্য সংশোধন করতে পারে?

এই সমস্যাগুলি সম্পর্কে, আমরা নীচের উন্নত এবং উন্নত বিভাগে সেগুলি বিস্তারিতভাবে বর্ণনা করব।
2. উন্নত জ্ঞান

রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্ট কোয়ান্টিটেটিভ পিসিআর সম্পর্কে, আমাদের অবশ্যই বাস্তবতা স্বীকার করতে হবে যে প্রতি বছর হাজার হাজার বৈজ্ঞানিক গবেষণা পত্র প্রকাশিত হয়, যার মধ্যে ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর প্রযুক্তি একটি ছোট সংখ্যা নয়।

ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর পরীক্ষা পরিমাপ করার জন্য কোন সাধারণ মান না থাকলে, ফলাফলগুলি ব্যাপকভাবে পরিবর্তিত হতে পারে।একই প্রজাতির একই জিনের জন্য, একই প্রক্রিয়াকরণ পদ্ধতির সাথে, সনাক্তকরণের ফলাফলগুলিও ব্যাপকভাবে পরিবর্তিত হবে এবং দেরিতে আসাদের জন্য একই ফলাফলের পুনরাবৃত্তি করা কঠিন হবে।আপনি কেউ জানেন না কোনটি সঠিক এবং কোনটি ভুল।

এর মানে কি ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর একটি প্রতারণা প্রযুক্তি বা একটি অবিশ্বস্ত প্রযুক্তি?না, এর কারণ হল ফ্লুরোসেন্ট কোয়ান্টিটেটিভ পিসিআর আরও সংবেদনশীল এবং আরও সঠিক, এবং একটু ভুল অপারেশন সম্পূর্ণ বিপরীত ফলাফল দেবে।একটি ছোট ক্ষতি হাজার মাইল দূরে.নিবন্ধের লেখক বারবার সমালোচকদের দ্বারা অত্যাচারিত হতে পারে।একই সময়ে, জার্নালের পর্যালোচনাকারীদের বিভিন্ন পরীক্ষামূলক ফলাফল থেকে বেছে নেওয়াও কঠিন।

সব মিলিয়ে, রিয়েল-টাইম পিসিআর পরীক্ষায় ঐকমত্যের অভাবকে নির্দেশ করে।এই লক্ষ্যে, শিল্পের সিনিয়র বিজ্ঞানীরা মান তৈরি করতে শুরু করেছিলেন,অবদানকারীদের এই মানগুলি পূরণ করার জন্য নিবন্ধে কিছু প্রয়োজনীয় পরীক্ষামূলক এবং ডেটা প্রক্রিয়াকরণের বিশদ (প্রয়োজনীয় ডেটা সহ) প্রদান করতে হবে।

পর্যালোচকরা এই বিবরণগুলি পড়ে পরীক্ষার গুণমান বিচার করতে পারেন;ভবিষ্যতের পাঠকরাও পরীক্ষাটি পুনরাবৃত্তি করতে বা পরীক্ষার উন্নতি করতে এটি ব্যবহার করতে পারেন।তারপরে এইভাবে প্রাপ্ত পরীক্ষামূলক ফলাফলগুলি তথ্যে পূর্ণ, উচ্চ মানের এবং ব্যবহারযোগ্য।

MIBBI (জৈবিক এবং বায়োমেডিকাল তদন্তের জন্য ন্যূনতম তথ্য -http://www.mibbi.org) হতে যাচ্ছে.MIBBI একটি প্রকল্প যা পরীক্ষার জন্য মান প্রদান করে.এটি প্রকৃতিতে প্রকাশিত হয়।এই প্রকল্পটি বিভিন্ন জৈবিক পরীক্ষা-নিরীক্ষার লক্ষ্যে, যার মধ্যে সেল বায়োলজি, মাইক্রোয়ারে, qPCR যা আমরা এখন আলোচনা করতে যাচ্ছি, ইত্যাদি, এবং পাণ্ডুলিপি জমা দেওয়ার সময় প্রতিটি ধরনের পরীক্ষার জন্য প্রদান করে।যে তথ্য সব সময়ে প্রদান করা উচিত.

এমআইবিবিআই প্রকল্পে, ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর সম্পর্কিত দুটি নিবন্ধ রয়েছে, যথা:
·আরডিএমএল (রিয়েল-টাইম পিসিআর ডেটা মার্কআপ ল্যাঙ্গুয়েজ) – রিয়েল-টাইম পরিমাণগত পিসিআর ডেটার জন্য একটি কাঠামোগত ভাষা এবং রিপোর্টিং গাইড;
· MIQE (পরিমাণগত রিয়েল-টাইম পিসিআর পরীক্ষা-নিরীক্ষার প্রকাশের জন্য ন্যূনতম তথ্য)- রিয়েল-টাইম পরিমাণগত পিসিআর পরীক্ষা-নিরীক্ষা সম্পর্কে নিবন্ধ প্রকাশের জন্য ন্যূনতম তথ্য।
প্রথমে, RDML সম্পর্কে কথা বলা যাক, পরিভাষা স্পেসিফিকেশন।

যদি সবকিছুর জন্য কোন আদর্শ সংজ্ঞা না থাকে, তাহলে আলোচনা চালিয়ে যাওয়া অসম্ভব, এই কারণেই পরীক্ষায় পদের ব্যাখ্যা এত গুরুত্বপূর্ণ।
ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর পরীক্ষায় ব্যবহৃত পরিভাষায় নিম্নলিখিত বিষয়বস্তু রয়েছে।QIAGEN আমাদের জন্য সেরা সারসংক্ষেপ তৈরি করেছে।নিম্নলিখিত সব শুকনোপণ্য .

পরিবর্ধন বক্ররেখা
পরিবর্ধন বক্ররেখা PCR প্রক্রিয়ার সময় তৈরি বক্ররেখাকে বোঝায়, যার মধ্যে চক্র সংখ্যাটি অ্যাবসিসা এবং রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্স তীব্রতাকে অর্ডিনেট হিসাবে প্রতিক্রিয়ার সময়।

একটি চমৎকার পরিবর্ধন বক্ররেখার নিম্নলিখিত বৈশিষ্ট্য থাকা উচিত: বেসলাইন সমতল বা সামান্য হ্রাস, এবং কোন সুস্পষ্ট ঊর্ধ্বমুখী প্রবণতা নেই;বক্ররেখার প্রবর্তন বিন্দু পরিষ্কার, এবং সূচকীয় পর্যায়ের ঢাল পরিবর্ধন দক্ষতার সমানুপাতিক।ঢাল যত বেশি, পরিবর্ধন দক্ষতা তত বেশি;সামগ্রিক পরিবর্ধন বক্ররেখা সমান্তরালতা ভাল, ইঙ্গিত করে যে প্রতিটি টিউবের পরিবর্ধন কার্যকারিতা একই রকম;কম ঘনত্বের নমুনার পরিবর্ধন বক্ররেখার সূচকীয় পর্যায় সুস্পষ্ট।

বেসলাইন (বেসলাইন)
বেসলাইন হল প্রারম্ভিক চক্রের শব্দ স্তর, সাধারণত 3য় এবং 15 তম চক্রের মধ্যে পরিমাপ করা হয়, কারণ এই সময়ের মধ্যে পরিবর্ধন পণ্য দ্বারা সৃষ্ট ফ্লুরোসেন্স মান বৃদ্ধি সনাক্ত করা যায় না।বেসলাইন গণনা করার জন্য ব্যবহৃত চক্রের সংখ্যা বৈচিত্র্যময় হতে পারে এবং উচ্চ টেমপ্লেট পরিমাণ ব্যবহার করা হলে বা লক্ষ্য জিনের অভিব্যক্তি স্তর বেশি হলে তা হ্রাস করার প্রয়োজন হতে পারে।

বেসলাইন সেট করার জন্য রৈখিক পরিবর্ধন বক্ররেখা থেকে ফ্লুরোসেন্স ডেটা দেখা প্রয়োজন।বেসলাইন সেট করা হয়েছে যাতে অ্যামপ্লিফিকেশন বক্ররেখার বৃদ্ধি বেসলাইন চক্র শীর্ষ সংখ্যার চেয়ে বড় একটি চক্র সংখ্যা দিয়ে শুরু হয়।প্রতিটি টার্গেট সিকোয়েন্সের জন্য বেসলাইন আলাদাভাবে সেট করতে হবে।প্রারম্ভিক চক্রে শনাক্ত হওয়া গড় প্রতিপ্রভ মানগুলিকে পরিবর্ধিত পণ্যগুলিতে প্রাপ্ত ফ্লুরোসেন্স মানগুলি থেকে বিয়োগ করতে হবে।বিভিন্ন রিয়েল-টাইম পিসিআর সফ্টওয়্যারের সর্বশেষ সংস্করণগুলি পৃথক নমুনার জন্য বেসলাইন সেটিংসের স্বয়ংক্রিয় অপ্টিমাইজেশনের অনুমতি দেয়।

পিসিআর পরিবর্ধন প্রতিক্রিয়ার প্রথম কয়েকটি চক্রের সময়, ফ্লুরোসেন্স সংকেত খুব বেশি পরিবর্তন হয় না।একটি সরল রেখার কাছে যাওয়াকে বেসলাইন বলা হয়, কিন্তু আমরা যদি প্রথম কয়েকটি চক্রের দিকে ঘনিষ্ঠভাবে তাকাই, আমরা দেখতে পাই যে নীচের ছবিতে যা ঘটছে তা বেসলাইনের মধ্যে রয়েছে।

ব্যাকগ্রাউন্ড ব্যাকগ্রাউন্ড বোঝায়
বিক্রিয়ায় অ-নির্দিষ্ট ফ্লুরোসেন্স মান।যেমন: অদক্ষ ফ্লুরোসেন্স quenching;বা এসওয়াইবিআর গ্রিন ব্যবহারের কারণে প্রচুর সংখ্যক ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ টেমপ্লেট।রিয়েল-টাইম পিসিআর সফ্টওয়্যার অ্যালগরিদম দ্বারা সিগন্যালের পটভূমি উপাদানগুলি গাণিতিকভাবে মুছে ফেলা হয়।

রিপোর্টার সংকেত
রিপোর্টার সিগন্যাল বলতে রিয়েল-টাইম পিসিআর চলাকালীন SYBR গ্রীন বা ফ্লুরোসেন্টলি লেবেলযুক্ত সিকোয়েন্স-নির্দিষ্ট প্রোব দ্বারা উত্পন্ন ফ্লুরোসেন্ট সংকেত বোঝায়।

নর্মালাইজড রিপোর্টার সিগন্যাল (আরএন)
RN প্রতিটি চক্রে পরিমাপিত প্যাসিভ রেফারেন্স রঞ্জকের ফ্লুরোসেন্স তীব্রতা দ্বারা বিভক্ত রিপোর্টার ডাই এর ফ্লুরোসেন্স তীব্রতা বোঝায়।

প্যাসিভ রেফারেন্স ডাই
কিছু রিয়েল-টাইম পিসিআর-এ,ফ্লুরোসেন্ট ডাই ROX ফ্লুরোসেন্ট সিগন্যালকে স্বাভাবিক করার জন্য একটি অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স হিসাবে ব্যবহৃত হয়.এটি ভুল পাইপটিং, ভাল অবস্থান, এবং ভাল-বাই-কূপ ভিত্তিতে ফ্লুরোসেন্স ওঠানামার কারণে বিভিন্নতার জন্য সংশোধন করে।

ফ্লুরোসেন্স থ্রেশহোল্ড (থ্রেশহোল্ড)
ব্যাকগ্রাউন্ড মানের উপরে এবং পরিবর্ধন বক্ররেখার মালভূমি মানের নীচে উল্লেখযোগ্যভাবে সামঞ্জস্য করা হয়েছিল।এটি অবশ্যই প্রশস্তকরণ বক্ররেখার রৈখিক অঞ্চলে অবস্থিত, পিসিআর সনাক্তকরণের লগ-রৈখিক পরিসরের প্রতিনিধিত্ব করে।থ্রেশহোল্ডগুলি লগ-এম্প্লিফিকেশন কার্ভ ভিউতে সেট করা উচিত যাতে পিসিআর-এর লগ-রৈখিক ফেজ সহজে সনাক্ত করা যায়।রিয়েল-টাইম পিসিআর-এ একাধিক টার্গেট জিন থাকলে, প্রতিটি টার্গেটের জন্য থ্রেশহোল্ড সেট করতে হবে।সাধারণত, PCR বিক্রিয়ার প্রথম 15 চক্রের ফ্লুরোসেন্স সিগন্যাল ফ্লুরোসেন্স ব্যাকগ্রাউন্ড সিগন্যাল হিসাবে ব্যবহৃত হয়, এবং ফ্লুরোসেন্স থ্রেশহোল্ড PCR এর প্রথম 3 থেকে 15 চক্রের ফ্লুরোসেন্স সিগন্যালের স্ট্যান্ডার্ড বিচ্যুতির 10 গুণ, এবং ফ্লুরোসেন্স থ্রেশহোল্ড প্রিসিআর অ্যামপ্লিফিকেশনের এক্সপোনসেন্ট ফেজে সেট করা হয়।সাধারণভাবে, প্রতিটি যন্ত্রের ব্যবহারের আগে তার ফ্লুরোসেন্স থ্রেশহোল্ড সেট করা থাকে।

সাইকেল থ্রেশহোল্ড (CT) বা ক্রসিং পয়েন্ট (CP)
যে চক্রে পরিবর্ধন বক্ররেখা থ্রেশহোল্ড অতিক্রম করে (অর্থাৎ, যে বিন্দুতে ফ্লুরোসেন্স সনাক্তকরণ উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পায়)।CT একটি ভগ্নাংশ হতে পারে এবং প্রারম্ভিক টেমপ্লেটের পরিমাণ গণনা করা যেতে পারে।প্রতিটি পিসিআর প্রতিক্রিয়া টিউবের ফ্লুরোসেন্ট সংকেত সেট থ্রেশহোল্ডে পৌঁছালে সিটি মানটি অনুভূত চক্রের সংখ্যা উপস্থাপন করে।প্রতিটি টেমপ্লেটের CT মান এবং টেমপ্লেটের প্রাথমিক কপি নম্বরের লগারিদমের মধ্যে একটি রৈখিক সম্পর্ক রয়েছে,প্রাথমিক কপি নম্বর যত বেশি হবে, CT মান তত কম হবে এবং এর বিপরীতে.পরিচিত প্রাথমিক কপি নম্বর সহ একটি স্ট্যান্ডার্ড ব্যবহার করে একটি আদর্শ বক্ররেখা তৈরি করা যেতে পারে, যেখানে অ্যাবসিসা CT মানকে প্রতিনিধিত্ব করে এবং অর্ডিনেট প্রাথমিক কপি নম্বরের লগারিদমকে উপস্থাপন করে।অতএব, যতক্ষণ না অজানা নমুনার CT মান পাওয়া যায়, ততক্ষণ নমুনার প্রাথমিক কপি নম্বরটি আদর্শ বক্ররেখা থেকে গণনা করা যেতে পারে।

ΔCT মান
ΔCT মান বর্ণনা করেলক্ষ্য জিন এবং সংশ্লিষ্ট অন্তঃসত্ত্বা রেফারেন্স জিন সিটি মান মধ্যে পার্থক্য, যেমন একটি হাউসকিপিং জিন, এবং ব্যবহৃত টেমপ্লেটের পরিমাণ স্বাভাবিক করতে ব্যবহৃত হয়:
⇒ΔCT = CT (টার্গেট জিন) - CT (এন্ডোজেনাস রেফারেন্স জিন)

ΔΔCT মান
ΔΔCT মান একটি আগ্রহের নমুনার গড় ΔΔCT মান (যেমন, উদ্দীপিত কোষ) এবং একটি রেফারেন্স নমুনার গড় ΔΔCT মান (যেমন, উদ্দীপিত কোষ) এর মধ্যে পার্থক্য বর্ণনা করে।রেফারেন্স নমুনাকে ক্রমাঙ্কন নমুনাও বলা হয় এবং অন্যান্য সমস্ত নমুনা আপেক্ষিক পরিমাণ নির্ধারণের জন্য এটিকে স্বাভাবিক করা হয়:
⇒ΔΔCT = গড় ΔCT (সুদের নমুনা) - গড় ΔCT (রেফারেন্স নমুনা)

এন্ডোজেনাস রেফারেন্স জিন (এন্ডোজেনাস রেফারেন্স জিন)
অন্তঃসত্ত্বা রেফারেন্স জিনের অভিব্যক্তি স্তর, যেমন হাউসকিপিং জিন (হাউসকিপিং জিন), নমুনার মধ্যে পার্থক্য করে না।লক্ষ্য জিনের সাথে রেফারেন্স জিনের CT মানগুলির তুলনা করা লক্ষ্য জিনের অভিব্যক্তি স্তরকে ইনপুট RNA বা cDNA এর পরিমাণে স্বাভাবিক করার অনুমতি দেয় (উপরের ΔCT মানগুলির বিভাগটি দেখুন)।

অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিন জন্য সঠিকRNA নমুনাগুলিতে সম্ভাব্য RNA অবক্ষয় বা এনজাইম ইনহিবিটারের উপস্থিতি, সেইসাথে RNA বিষয়বস্তুর তারতম্য, বিপরীত প্রতিলিপি কার্যকারিতা, নিউক্লিক অ্যাসিড পুনরুদ্ধার এবং নমুনা পরিচালনা।সর্বোত্তম রেফারেন্স জিন(গুলি) নির্বাচন করতে, আমরা পরীক্ষামূলক সেটিং এর উপর নির্ভর করে সর্বোত্তম রেফারেন্স নির্বাচনের অনুমতি দেওয়ার জন্য অ্যালগরিদম সংশোধন করেছি।

অভ্যন্তরীণ নিয়ন্ত্রণ
একটি কন্ট্রোল সিকোয়েন্স যা টার্গেট সিকোয়েন্সের মতো একই বিক্রিয়ায় বিবর্ধিত হয় এবং একটি ভিন্ন প্রোবের (অর্থাৎ, ডুপ্লেক্স পিসিআর সম্পাদন) দ্বারা অনুসন্ধান করা হয়।অভ্যন্তরীণ নিয়ন্ত্রণগুলি প্রায়শই ব্যর্থ পরিবর্ধনগুলি বাতিল করতে ব্যবহৃত হয়, যেমন লক্ষ্য ক্রম সনাক্ত করা হয় না।
ক্রমাঙ্কন নমুনা
একটি রেফারেন্স নমুনা (উদাহরণস্বরূপ, একটি সেল লাইন বা টিস্যু থেকে বিশুদ্ধ আরএনএ) আপেক্ষিক পরিমাণে ব্যবহৃত একটি জিনের আপেক্ষিক অভিব্যক্তি স্তর নির্ধারণ করতে অন্যান্য সমস্ত নমুনার তুলনা করতে।ক্রমাঙ্কন নমুনা যে কোনও নমুনা হতে পারে, তবে সাধারণত একটি নিয়ন্ত্রণ (উদাহরণস্বরূপ, একটি চিকিত্সা না করা নমুনা বা পরীক্ষার সময় শূন্য থেকে একটি নমুনা)।

ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ
সঙ্গে নিয়ন্ত্রণ প্রতিক্রিয়া ব্যবহার করুনটেমপ্লেট পরিচিত পরিমাণ.একটি প্রাইমার সেট বা প্রাইমার-প্রোব সেট সঠিকভাবে কাজ করছে এবং প্রতিক্রিয়া সঠিকভাবে সেট আপ করা হয়েছে কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য প্রায়ই ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ ব্যবহার করা হয়।

নো টেমপ্লেট কন্ট্রোল (NTC)
একটি নিয়ন্ত্রণ প্রতিক্রিয়া যা টেমপ্লেট ছাড়া পরিবর্ধন প্রতিক্রিয়ার সমস্ত প্রয়োজনীয় উপাদান ধারণ করে, যা সাধারণত জল দিয়ে প্রতিস্থাপিত হয়।এনটিসি ব্যবহার বিকারক দূষণ বা বিদেশী ডিএনএ দ্বারা সৃষ্ট দূষণ খুঁজে পেতে পারে, এইভাবে সনাক্তকরণ ডেটার সত্যতা এবং নির্ভরযোগ্যতা নিশ্চিত করে।এনটিসি নিয়ন্ত্রণের পরিবর্ধন দূষণ নির্দেশ করে।

নো আরটি কন্ট্রোল (NRT)
আরএনএ নিষ্কাশন প্রক্রিয়ায় অবশিষ্ট জিনোমিক ডিএনএ থাকতে পারে, যা অত্যন্ত ক্ষতিকারক এবং এটি ডেটার গুণমানকে প্রভাবিত করে এবং qPCR-এর প্রাকৃতিক শত্রু হিসেবে অপরাধী, তাই পরীক্ষা-নিরীক্ষা করার সময়, এটি শুধুমাত্র RNA সনাক্তকরণকে প্রশস্ত করার জন্য ডিজাইন করা আবশ্যক।দুটি উপায় আছে, একটি হল ইন্ট্রোন জুড়ে প্রাইমার ডিজাইন করা, অন্যটি হল সম্পূর্ণভাবে ডিএনএ অপসারণ করা, কোনটি ভাল, যা পরে আলোচনা করা হবে।এনটিআর কন্ট্রোল ডিএনএ দূষণ সনাক্ত করার জন্য একটি জাদু আয়না।যদি প্রশস্তকরণ হয়, তার মানে দূষণ আছে।

মান
স্ট্যান্ডার্ডগুলি পরিচিত ঘনত্বের নমুনা বা অনুলিপি নম্বর যা একটি আদর্শ বক্ররেখা তৈরি করতে ব্যবহৃত হয়।স্ট্যান্ডার্ডের স্থায়িত্ব নিশ্চিত করার জন্য, জিন খণ্ডটি সাধারণত প্লাজমিডে ক্লোন করা হয় এবং স্ট্যান্ডার্ড হিসাবে ব্যবহার করা হয়।

আদর্শ বক্ররেখা
সাধারণত দ্বিগুণ অনুপাত অনুসারে মানক পণ্যের সাথে কমপক্ষে 5টি ঘনত্বের গ্রেডিয়েন্টে মিশ্রিত করা হয়, এবং CT মান এবং অনুলিপি নম্বরের স্থানাঙ্কে 5 পয়েন্ট আঁকা হয় এবং একটি স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখা তৈরি করার জন্য বিন্দুগুলিকে সংযুক্ত করা হয়।প্রতিটি আদর্শ বক্ররেখার জন্য, এর বৈধতা পরীক্ষা করা দরকার।ঢালের মান –3.3 এবং –3.8-এর মধ্যে পড়ে এবং প্রতিটি ঘনত্ব ত্রিগুণে সঞ্চালিত হয়।অন্যান্য পয়েন্ট থেকে উল্লেখযোগ্যভাবে আলাদা যে পয়েন্টগুলি বাতিল করা উচিত।যে নমুনাটি পরীক্ষা করা হবে তার CT মানকে স্ট্যান্ডার্ড কার্ভের মধ্যে আনা হয় এবং যে নমুনাটি পরীক্ষা করা হবে তার এক্সপ্রেশন লেভেল গণনা করা যেতে পারে।

যে নমুনা পরীক্ষা করা হবে তার CT মানকে স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখায় আনা হয় এবং যে নমুনা পরীক্ষা করা হবে তার প্রাথমিক কপি নম্বর গণনা করা যেতে পারে।

দক্ষতা এবং ঢাল
স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখার ঢাল রিয়েল-টাইম পিসিআর-এর দক্ষতার প্রতিনিধিত্ব করে।
-3.322 এর একটি ঢাল নির্দেশ করে যে পিসিআর পরিবর্ধন দক্ষতা 1, বা 100% দক্ষ, এবং প্রতিটি চক্রে পিসিআর পণ্যের পরিমাণ দ্বিগুণ হয়।
-3.322 এর কম ঢাল (যেমন, -3.8) একটি পিসিআর দক্ষতা নির্দেশ করে
-3.322-এর চেয়ে বেশি একটি ঢাল (যেমন, -3.0) নির্দেশ করে যে পিসিআর কার্যকারিতা 100% এর বেশি বলে মনে হচ্ছে, যা কৌতূহলজনক, কিভাবে পিসিআরের একটি চক্র দ্বিগুণের বেশি পরিবর্ধিত পণ্য তৈরি করতে পারে?এই পরিস্থিতিটি পিসিআর প্রতিক্রিয়ার অ-রৈখিক পর্যায়ে ঘটে, অর্থাৎ, প্রচুর পরিমাণে অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন রয়েছে।

গলে যাওয়া বক্ররেখা
qPCR পরিবর্ধন সম্পন্ন হওয়ার পরে, PCR পণ্যটি উত্তপ্ত হয়।তাপমাত্রা বৃদ্ধির সাথে সাথে ডবল-স্ট্র্যান্ডেড অ্যামপ্লিফিকেশন পণ্যটি ধীরে ধীরে গলে যায়, যার ফলে প্রতিপ্রভের তীব্রতা হ্রাস পায়।যখন একটি নির্দিষ্ট তাপমাত্রা (Tm) পৌঁছে যায়, তখন প্রচুর সংখ্যক পণ্য গলে যাবে।ফ্লুরোসেন্স তীব্রভাবে কমে যায়।বিভিন্ন পিসিআর পণ্যের বিভিন্ন টিএম মান এবং বিভিন্ন গলে যাওয়া তাপমাত্রা থাকে, যাতে পিসিআরের নির্দিষ্টতা সনাক্ত করা যায়।

গলানো বক্ররেখা (উৎপন্ন বক্ররেখা)
গলে যাওয়া বক্ররেখাটি একটি শীর্ষ মানচিত্র তৈরি করার জন্য উদ্ভূত হয়েছে, যা পিসিআর পণ্যের টুকরোগুলির পরিস্থিতি আরও স্বজ্ঞাতভাবে প্রদর্শন করতে পারে।যেহেতু গলে যাওয়া তাপমাত্রা হল DNA খণ্ডের Tm মান, তাই কিছু পরামিতি যা DNA খণ্ডের Tm মানকে প্রভাবিত করে তা বিচার করা যেতে পারে, যেমন খণ্ডের আকার, GC বিষয়বস্তু ইত্যাদি। সাধারণভাবে বলতে গেলে, আমাদের প্রাইমার ডিজাইনের নীতি অনুসারে,পরিবর্ধিত পণ্যের দৈর্ঘ্য 80-300bp এর মধ্যে, তাই গলানোর তাপমাত্রা 80°C থেকে 90°C এর মধ্যে হওয়া উচিত।

গলে যাওয়া বক্ররেখার ব্যাখ্যা: যদি একমাত্র প্রধান শিখরটি 80°C-90°C এর মধ্যে দেখা যায়, তাহলে এর অর্থ হল ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত PCR নিখুঁত;যদি প্রধান শিখর 80°C-90°C এর মধ্যে দেখা যায় এবং বিবিধ চূড়া 80°C এর নিচে দেখা যায়, তাহলে প্রাইমার ডাইমার মূলত বিবেচনা করা হয়।আপনি এটি সমাধান করার জন্য annealing তাপমাত্রা বৃদ্ধি করার চেষ্টা করতে পারেন;যদি প্রধান শিখরটি 80°C-90°C এর মধ্যে দেখা যায়, এবং তাপমাত্রা বৃদ্ধির সাথে সাথে বিবিধ শিখরটি আবার প্রদর্শিত হয়, তবে এটি মূলত বিবেচনা করা হয় যে ডিএনএ দূষণ রয়েছে এবং পরীক্ষার প্রাথমিক পর্যায়ে ডিএনএ অপসারণ করা প্রয়োজন।

অবশ্যই, এখনও কিছু অস্বাভাবিক পরিস্থিতি রয়েছে, যা নীচে একটি একটি করে ভেঙে যাবে।
3. উন্নত জ্ঞান

qPCR করতে, আমাকে MIQE বলতে হবে,ন্যূনতম তথ্যএর প্রকাশনার জন্যপরিমাণগতরিয়েল-টাইম পিসিআরপরীক্ষা-নিরীক্ষা—বাস্তব-সময় পরিমাণগত পিসিআর সম্পর্কে নিবন্ধ প্রকাশের ন্যূনতম তথ্যপরীক্ষাপ্রত্যেকের বোঝার সহজ করার জন্য, আমরা মূল বিষয়বস্তু সহজতর করব।

আপনি ইন্টারনেটে MIQE এর মূল পাঠ্যটি অনুসন্ধান করতে পারেন এবং সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ বিষয় হল এটি শর্ত দেয় যেডেটা চেকলিস্ট যা একটি নিবন্ধ প্রকাশ করার সময় প্রদান করা প্রয়োজন .

পর্যালোচকরা এই বিবরণগুলি পড়ে পরীক্ষার গুণমান বিচার করতে পারেন;ভবিষ্যতের পাঠকরাও পরীক্ষাটি পুনরাবৃত্তি বা উন্নত করতে এটি ব্যবহার করতে পারেন।
এটি লক্ষণীয় যে এই তালিকায়, প্রতিটি তালিকার গুরুত্ব যথাক্রমে E বা D দিয়ে চিহ্নিত করা হয়েছে।এর মানে কী?ই: প্রয়োজনীয় তথ্য (জমা দিতে হবে);D: পছন্দসই তথ্য (যতটা সম্ভব প্রদান করুন)।

MIQE (1)- পরীক্ষামূলক নকশা
অনেক স্কামব্যাগ যারা তাদের স্নাতক অধ্যয়ন শেষ করার পরে তাদের প্রতিরক্ষা সম্পন্ন করেছে তারা জানে না কিভাবে স্বাধীনভাবে একটি পরীক্ষা ডিজাইন করতে হয়, তাদের নোটবুক খুলতে হয় এবং শিক্ষক তাদের যা করতে বলেন তা করতে পারেন।ফলস্বরূপ, পরীক্ষামূলক নকশা কঠোর ছিল না, এবং ম্যাগাজিনের সম্পাদকীয় বিভাগ বলেছিল যে তারা এই ছবিটি এবং সেই ছবিটি তৈরি করতে চেয়েছিল, তাই তারা ধাঁধায় এটি করেছে।এভাবেই তৈরি হয় বখাটেরা!

বাড়ির কাছাকাছি, পরীক্ষার প্রথম নীতি নির্ধারণ করা হয়পরীক্ষামূলক যুক্তির কঠোরতা.সবচেয়ে মৌলিক বিষয় হল পরীক্ষামূলক নকশা, এবং পরীক্ষামূলক নকশা সম্পর্কে সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ বিষয় হল লক্ষ্য নমুনা, রেফারেন্স নমুনা (নিয়ন্ত্রণ) এবং পুনরাবৃত্তির সংখ্যা কিভাবে সেট করা যায়, যাতে পরীক্ষামূলক ডেটা রেফারেন্স, তুলনীয় এবং বিশ্বাসযোগ্য হতে পারে।

লক্ষ্য নমুনাএকটি নির্দিষ্ট চিকিত্সার পরে আমাদের লক্ষ্য জিন সনাক্ত করতে প্রয়োজন এমন নমুনাকে বোঝায়।রেফারেন্স নমুনাকোন চিকিৎসা ছাড়াই নমুনা, যাকে জীববিজ্ঞানে প্রায়ই বন্য প্রকার বলা হয়।

পরীক্ষামূলক প্রতিলিপিখুবই গুরুত্বপূর্ণ।সাধারণত, অনুপ্রেরণামূলক প্রতিলিপির সংখ্যা তিনের বেশি হতে হবে।জৈবিক প্রতিলিপি কী এবং প্রযুক্তিগত প্রতিলিপি কী তা আলাদা করা দরকার।

জৈবিক প্রতিলিপি: বিভিন্ন উপকরণ (সময়, গাছপালা, ব্যাচ, প্রতিক্রিয়া প্লেট) দিয়ে একই যাচাইকরণ পরীক্ষা করা হয়েছে।

জৈবিক নকল
একটি উদাহরণ হিসাবে মরিচের কীটনাশক চিকিত্সা নেওয়া যাক।আমরা ABC-এর তিনটি উদ্ভিদে কীটনাশক স্প্রে করতে চাই, তারপর ABC-এর তিনটি উদ্ভিদ হল তিনটি জৈবিক প্রতিলিপি, এবং সেগুলি বিভিন্ন উপকরণ দিয়ে একই যাচাইকরণ পরীক্ষা।কিন্তু একটি পরীক্ষা হিসাবে, একটি নিয়ন্ত্রণ অবশ্যই প্রয়োজন, তাই আমরা উদ্ভিদ A এর একটি পরীক্ষামূলক গ্রুপ তৈরি করতে উদ্ভিদ A এর শাখাগুলির একটিকে স্প্রে করতে পারি এবং একটি নিয়ন্ত্রণ গ্রুপ তৈরি করতে উদ্ভিদ A এর অন্যান্য শাখাগুলিকে স্প্রে করতে পারি না।B এবং C এর জন্যও একই কাজ করুন।

প্রযুক্তিগত প্রতিলিপি (প্রযুক্তিগত প্রতিলিপি): এটি একটি পুনরাবৃত্ত পরীক্ষা যা অপারেশনের কারণে সৃষ্ট ত্রুটিগুলি এড়াতে ডিজাইন করা হয়েছে, যা আসলে একই উপাদানের অন্তর্ভুক্ত একটি ডুপ্লিকেট গর্ত৷উভয় চিকিত্সা এবং নিয়ন্ত্রণ লক্ষ্য জিন এবং অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিনের প্রতিলিপি সেটিংস (সর্বনিম্ন তিনটি) থাকতে হবে।

প্রযুক্তিগত পুনরাবৃত্তি
কীটনাশক দিয়ে চিকিত্সা করা মরিচটিকে আবার উদাহরণ হিসাবে নিন।উদ্ভিদ A এর পরীক্ষামূলক গোষ্ঠীর জন্য, আমরা তার লক্ষ্য জিন এবং অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিনের জন্য যথাক্রমে 1, 2, এবং 3 এর তিনটি PCR গর্ত তৈরি করেছি, যাতে সনাক্তকরণের পরে গড় নেওয়া যায়।উদ্ভিদ নিয়ন্ত্রণের জন্য A গ্রুপগুলিও একইভাবে চিকিত্সা করা হয়।একইভাবে, বি এবং সি উদ্ভিদের জন্য একই চিকিত্সা করুন।এটি প্রযুক্তিগত পুনরাবৃত্তি।

এটা যে মূল্যপরিসংখ্যানে যা প্রবেশ করে তা হ'ল জৈবিক পুনরাবৃত্তি, এবং প্রযুক্তিগত পুনরাবৃত্তি হল পরীক্ষামূলক প্রক্রিয়ায় কোনও এলোমেলো ঘটনা আছে কিনা তা পরীক্ষা করা, যাতে পরীক্ষামূলক ফলাফলগুলিকে বিশ্বাসযোগ্য করে তোলা যায়, অর্থাৎ আমরা প্রায়শই বলে থাকি তাদের গড় নিয়ে ত্রুটিগুলি এড়াতে।

নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ - এনটিসি এবং এনআরটি
NTC (নো-টেমপ্লেট কন্ট্রোল), একটি টেমপ্লেট ছাড়া একটি নিয়ন্ত্রণ, পরীক্ষামূলক উপাদান দূষিত কিনা তা যাচাই করতে ব্যবহৃত হয়।সাধারণত, জল একটি টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহৃত হয়।যদি একটি ফ্লুরোসেন্ট প্রতিক্রিয়া থাকে তবে এটি নির্দেশ করে যে পরীক্ষাগারে নিউক্লিক অ্যাসিড দূষণ ঘটেছে।

এই দূষণগুলি থেকে আসে: অপরিষ্কার জল, অযোগ্য বিকারক যার মধ্যে অন্তঃসত্ত্বা ডিএনএ, প্রাইমার দূষণ, পরীক্ষাগারের সরঞ্জামের দূষণ, এরোসল দূষণ ইত্যাদির জন্য RNase স্ক্যাভেঞ্জার এবং RNase ইনহিবিটর ব্যবহার করতে হবে।অ্যারোসল দূষণ খুঁজে পাওয়া সবচেয়ে কঠিন।কল্পনা করুন আপনার পরীক্ষাগারটি ধোঁয়াশার মতো, বিভিন্ন নিউক্লিক অ্যাসিড বাতাসে ঝুলে আছে।

NRT (নো-রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ), রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন ছাড়া নিয়ন্ত্রণ, একটি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে নন-রিভার্স ট্রান্সক্রিপড RNA, যা gDNA অবশিষ্টাংশের নিয়ন্ত্রণ।

জিন এক্সপ্রেশন করার সময়, রিভার্স ট্রান্সক্রিপশনের পরে সিডিএনএর পরিমাণ সনাক্ত করে আরএনএর পরিমাণ সনাক্ত করা হয়।আরএনএ শুদ্ধ করার সময় যদি জিডিএনএ অবশিষ্টাংশ থাকে তবে এটি পরীক্ষামূলক ফলাফলে ত্রুটি সৃষ্টি করবে, কারণ প্রাপ্ত প্রকৃত ফলাফলগুলি হল জিডিএনএ এবং সিডিএনএ।সামগ্রিক স্তরে, শুধু সিডিএনএ নয়, আরএনএ নিষ্কাশনের সময় জিডিএনএকে সম্পূর্ণরূপে অপসারণ করতে হবে।

MIQE (2)- নমুনা তথ্য
তথাকথিত নমুনা তথ্যের অর্থ হল যখন আমরা qPCR সম্পর্কে একটি নিবন্ধ প্রকাশ করি, তখন আমাদের অবশ্যই নমুনা তথ্যটি স্পষ্টভাবে ব্যাখ্যা করতে হবে, যা নিবন্ধের একটি অপরিহার্য অংশ।একইভাবে, যখন আমরা নমুনাগুলি প্রক্রিয়া করি, তখন নমুনার বৈধতা নিশ্চিত করার জন্য আমাদের নিজস্ব ক্রিয়াকলাপগুলিকেও নিয়ন্ত্রণ করতে হবে।

নমুনার বিবরণ শুধুমাত্র একটি ফলাফল, এবং আমাদের পুরো পরীক্ষার সময় নেওয়া উপকরণগুলিতে আরও মনোযোগ দেওয়া উচিত।

পরীক্ষামূলক উপকরণ নির্বাচন
রক্তের নমুনা - তাজা রক্ত ​​চয়ন করুন, 4 ঘন্টার বেশি নয়।কোষের নমুনা - জোরালো বৃদ্ধির সময়কালে তাজা কোষ সংগ্রহ করতে বেছে নিন।প্রাণীর টিস্যু - তাজা, জোরালোভাবে ক্রমবর্ধমান টিস্যু চয়ন করুন।উদ্ভিদ টিস্যু - তাজা, তরুণ টিস্যু চয়ন করুন।

আপনি অবশ্যই লক্ষ্য করেছেন যে এই কয়েকটি বাক্যে একটি মূল শব্দ রয়েছে: তাজা।
উপরের নমুনার জন্য, বাজারে সবচেয়ে ভাল, সাশ্রয়ী এবং স্থিতিশীল কিট হল Foregene's kit, যা দ্রুত এবং সহজে তাদের DNA এবং RNA বের করতে পারে।

রক্তের ডিএনএ মিনি কিট

সেল টোটাল আরএনএ আইসোলেশন কিট

পশু মোট RNA বিচ্ছিন্নতা কিট

উদ্ভিদ মোট RNA বিচ্ছিন্নতা কিট

প্ল্যান্ট টোটাল আরএনএ আইসোলেশন কিট প্লাস

প্ল্যান্ট ডিএনএ আইসোলেশন কিট

পরীক্ষামূলক উপকরণ সঞ্চয়
সাধারণভাবে বলতে গেলে, শর্ত অনুমতি দিলে আমরা নমুনা সংরক্ষণের সুপারিশ করি না।যাইহোক, এমন অনেক বন্ধু আছেন যারা নমুনা নেওয়ার পরপরই পরীক্ষা-নিরীক্ষা করতে পারেন না, এবং কিছুকে এমনকি স্যাম্পলিংয়ের জন্য তরল নাইট্রোজেন ট্যাঙ্কগুলিকে মাঠে নিয়ে যেতে হয়।

এই ধরণের কঠোর পরিশ্রমী বন্ধুর জন্য, আমি কেবল বলতে পারি যে আপনি বিকারক ভোগ্য সামগ্রী বোঝেন না।এখন অনেক রিএজেন্ট ব্যবহারযোগ্য কোম্পানি রিএজেন্ট তৈরি করে যা ঘরের তাপমাত্রায় আরএনএ নমুনা সংরক্ষণ করতে পারে এবং আপনি সেগুলি ব্যবহার করতে বেছে নিতে পারেন।প্রচলিত স্টোরেজ পদ্ধতি হল তরল নাইট্রোজেন স্টোরেজ, একটি ছোট তরল নাইট্রোজেন ট্যাঙ্ক ব্যবহার করে যা বহন করা সহজ।নমুনাটি পরীক্ষাগারে ফিরিয়ে আনার পর, এটি একটি -80°C রেফ্রিজারেটরে সংরক্ষণ করুন।

আরএনএ জড়িত পরীক্ষার জন্য, ছয়-শব্দ নীতি অনুসরণ করা আবশ্যক:নিম্ন তাপমাত্রা, কোন এনজাইম নেই,এবংদ্রুত .

নিম্ন তাপমাত্রার ধারণাটি বোঝা সহজ;এনজাইম ছাড়া, RNase আমরা যে পৃথিবীতে বাস করি তার সর্বত্রই রয়েছে (অন্যথায় আপনি এইচআইভি দ্বারা মারা যেতেন), তাই পরীক্ষা করার সময় কীভাবে RNase এড়ানো যায় তা একটি অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ ধারণা;দ্রুত,পৃথিবীতে এমন কোনো কুংফু নেই যা ভাঙা যায় না, শুধু গতি ভাঙা যায় না.

অতএব, এক অর্থে, নিষ্কাশন সময় যত কম হবে, কিট তত ভাল।কেনফরজিনএর কিট গতির উপর জোর দেয়, কারণ তারা এটি ভাল করেই জানে।

PS: কিছু মেয়েরা খুব সাবধানে পরীক্ষা-নিরীক্ষা করে, কিন্তু তারা বেশ কয়েক বছর কাজ করার পরে স্ল্যাম ডাঙ্কের মতো ভাল নয়।তারা মনে করে যে ঈশ্বর অন্যায্য, অন্যদের সম্পর্কে অভিযোগ করে এবং জীবন খুঁজছেন।আসলে, সে এটা বুঝতে পারেনি।তিনি আরএনএকে ভালোভাবে রক্ষা করতে পারেননি, এবং স্ল্যাম ডাঙ্ক প্লেয়ারটি ছিল চতুর।তিনি যখন পরীক্ষাটি করছিলেন, তখন তিনি ভেবেছিলেন যে তিনি তিনবার, পাঁচবার এবং দুটি বিভাগ দিয়ে স্ল্যাম ডাঙ্ক শেষ করবেন, তবে তিনি পরীক্ষাটি ভাল করেছিলেন।

বিঃদ্রঃ: ধীর, RNase আক্রমণের সম্ভাবনা বেশি।কিভাবে নিজেকে দ্রুত হতে প্রশিক্ষণ?কোন উপায় নেই, শুধু আরও অনুশীলন করুন।

বিভিন্ন পরীক্ষা এবং বিভিন্ন নমুনার জন্য, এটি এখনও আরও সাহিত্য পড়া এবং প্রক্রিয়াকরণের জন্য একটি উপযুক্ত পদ্ধতি নির্বাচন করা প্রয়োজন।নমুনা সংগ্রহ এবং স্টোরেজ প্রক্রিয়ার জন্য, MIQE-এর প্রয়োজন যে এটি অবশ্যই কাগজে স্পষ্টভাবে লিখতে হবে, যাতে পর্যালোচকরা কাগজটির নির্ভরযোগ্যতা পর্যালোচনা করতে পারেন, এবং হতবাক তরুণদের জন্য আপনার পরীক্ষার পুনরাবৃত্তি করাও সুবিধাজনক।

যদিও জৈবিক পরীক্ষা-নিরীক্ষা কঠিন, তবে সেগুলো উচ্চমানের।আপনি যদি সতর্ক না হন তবে আপনি পৃথিবীকে উল্টে দিতে পারেন।উদাহরণস্বরূপ, SARS কে জৈব রাসায়নিক সংকটে পরিণত করা, বা 1.3 বিলিয়ন মানুষকে বাঁচাতে হাইব্রিড চাল তৈরি করা।নীচের ছবিটি একটি রাসায়নিক পরীক্ষা, আপনি শুধুমাত্র তার শিশ্ন মত চেহারা দেখে আপনার গবেষণার জন্য কতটা গর্বিত তা বুঝতে হবে।ভুলে যাও, তাকে কালো করো না।

MIQE (3) - নিউক্লিক অ্যাসিড নিষ্কাশন।
নিউক্লিক অ্যাসিড নিষ্কাশন একটি বড় ঘটনা, এবং সমস্ত আণবিক জীববিজ্ঞান পরীক্ষা নিউক্লিক অ্যাসিড নিষ্কাশন দিয়ে শুরু হয়।প্রথমত, নিউক্লিক অ্যাসিড নিষ্কাশনের উপর MIQE এর বিষয়বস্তু অনুলিপি করা যাক।

এই ফর্মের দিকে তাকিয়ে, আপনি পৃষ্ঠে থাকতে পারবেন না।ফর্ম একটি মতবাদ.একটি শীর্ষ ছাত্র হতে, আপনি কেন জিজ্ঞাসা করতে হবে.এই টেবিলের অপরিহার্য বিষয়বস্তু হল: অনুসরণ করুনRNA এর বিশুদ্ধতা, অখণ্ডতা, সামঞ্জস্যতা এবং নিষ্কাশনের পরিমাণ .

এর প্রথম অংশপ্রক্রিয়া বা যন্ত্র হল নিউক্লিক অ্যাসিড নিষ্কাশন পদক্ষেপ।আপনি যদি নিষ্কাশনের জন্য একটি স্বয়ংক্রিয় নিউক্লিক অ্যাসিড এক্সট্র্যাক্টর ব্যবহার করেন (উন্নত, ক্রয়ের জন্য দয়া করে আমার সাথে যোগাযোগ করুন), আপনাকে যন্ত্রটির মডেল নাম নির্দেশ করতে হবে।

কিটের নাম এবং

পরিবর্তনের বিশদ বিবরণের জন্য কি কিট ব্যবহার করা হয়েছিল, কোন বিশেষ বিকারক যোগ করা হয়েছিল বা কোন বিশেষ ক্রিয়াকলাপগুলি করা হয়েছিল তা স্পষ্টভাবে ব্যাখ্যা করা উচিত যাতে অন্যরা সহজেই আপনার পরীক্ষার পুনরাবৃত্তি করতে পারে।

কিছু লোক বিশেষ নমুনা বের করার সময় কিছু বিশেষ বিকারক যোগ করে, এই ভেবে যে এটি তাদের গোপন অস্ত্র এবং অন্যকে বলবেন না।এটি গোপন রাখার সময়, তারা আপনার নিবন্ধটি উজ্জ্বল করার সুযোগও হারায়।চালাক হবেন না, আপনাকে বৈজ্ঞানিক গবেষণায় দেশের পুরানো ঝাং-এর চেয়ে বেশি সৎ হতে হবে, আপনি যদি চতুর হতে চান তবে নিবন্ধটি আপনাকে বোকা করে তুলবে।

কিটের পণ্য নম্বর মনে রাখতে হবেযখন আপনি কিট অর্ডার করবেন এবং নিবন্ধটি লিখবেন।কিটটিতে সাধারণত দুটি সংখ্যা থাকে: ক্যাট-ক্যাটালগ নম্বর (পণ্য নম্বর, নিবন্ধ নম্বর), লট-পণ্যের লট নম্বর ( পণ্যটি কোন ব্যাচ থেকে এসেছে তা বোঝাতে ব্যবহৃত হয়)।

উপরন্তু, জৈব রাসায়নিক রিএজেন্ট অর্ডার করার সময় প্রায়ই CAS নম্বর ব্যবহার করা হয় এবং আমি এটি একসাথে জনপ্রিয় করব।CAS নম্বর হল আমেরিকান কেমিক্যাল সোসাইটি প্রতিটি নতুন রাসায়নিক ওষুধের জন্য প্রদত্ত নম্বর।সাধারণত, তিনটি সংখ্যা একটি ড্যাশ দ্বারা সংযুক্ত করা হয়।রুশুই এর সিএএস নম্বর: 7732-18-5।রাসায়নিকের প্রায়ই একাধিক উপনাম থাকে, তবে CAS নম্বরটি অনন্য।ওষুধ অর্ডার করার সময়, আপনি প্রথমে এটির CAS নম্বর পরীক্ষা করতে পারেন।

বাড়ির কাছাকাছি, কেন আমাদের এই জিনিসগুলি পরিষ্কারভাবে বর্ণনা করতে হবে?আসলে, এটি আরএনএ নিষ্কাশনের গুণমান পরীক্ষা করাও।যন্ত্র এবং কিটগুলির ব্যবহার আরএনএ নিষ্কাশনকে আরও সামঞ্জস্যপূর্ণ করে তুলবে।সাধারণ পরীক্ষাগারের নিষ্কাশন স্কেল বড় নয়, এবং এটি কিট দিয়ে প্রাপ্ত করা যেতে পারে।

DNase বা RNase চিকিত্সার বিবরণ
ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর-এর গুরুত্বপূর্ণ বিষয় হল ডিএনএ দূষণ প্রতিরোধ করা, এবং দূষণ থাকলে পরীক্ষা না করা।অতএব, পরীক্ষামূলক প্রক্রিয়ায় ডিএনএ সম্পূর্ণরূপে এবং সম্পূর্ণরূপে সরানো হয়েছে তা প্রদর্শন করার জন্য, আপনি ডিএনএ প্রক্রিয়া করার জন্য যে প্রক্রিয়াটি ব্যবহার করেছিলেন তা বর্ণনা করা অপরিহার্য।একটি পরিকল্পিত চিত্র দ্বারা উপস্থাপিত।

RNA এবং DNA এর পরিকল্পিত চিত্র
সাধারণভাবে, ডিএনএ অপসারণের পদ্ধতি হল নিষ্কাশনের পরে ডিএনএ দিয়ে আরএনএকে চিকিত্সা করা।যাইহোক, এগুলি তুলনামূলকভাবে পুরানো পদ্ধতি।বাণিজ্যিক RNA নিষ্কাশন কিট DNase যোগ না করে নিষ্কাশন প্রক্রিয়া চলাকালীন DNA অপসারণ করতে সক্ষম হয়েছে।উদাহরণস্বরূপ, Foregene থেকে কিটগুলির একটি সিরিজ।

বিঃদ্রঃ: আরএনএ নিষ্কাশনের সময় ডিএনএ অপসারণ করা একটি অত্যন্ত বিপজ্জনক দ্বি-ধারী তলোয়ার, যা আরএনএ নিষ্কাশনের অপারেশন সময়কে দীর্ঘায়িত করবে এবং আরএনএ অবক্ষয়ের ঝুঁকি বাড়াবে।মূলত, এটি আরএনএ ফলন এবং বিশুদ্ধতার মধ্যে একটি বাণিজ্য বন্ধ।

উপরন্তু, সিলিকা-ভিত্তিক শোষণ কলামে যোগ করা DNase-এর পরিমাণ খুবই কম, এবং প্রভাব অর্জনের জন্য উচ্চ-মানের DNase ব্যবহার করতে হবে।অঅপ্টিমাইজড ডিনেস দ্রুত এবং সম্পূর্ণরূপে হজম করা যায় না।এটি বণিকের প্রযুক্তিগত স্তরের একটি পরীক্ষা।অবশ্যই, আরও অদ্ভুত ব্যবসায়ী আছে যারা গর্ব করে যে ডিএনএ ডিএনএ ছাড়াই সরানো যেতে পারে।এটা বলা যেতে পারে যে যে কেউ বড়াই করে যে ডিএনএ ডিএনএ ছাড়াই সম্পূর্ণরূপে অপসারণ করা যায় সে একজন গুন্ডা।ডিএনএ একটি অপেক্ষাকৃত স্থিতিশীল ডবল-স্ট্র্যান্ডেড গঠন, এবং এটি কেবল কথা বলে এবং হাসি দিয়ে মুছে ফেলা যায় না।

দূষণ মূল্যায়ন
মূল্যায়ন পদ্ধতি: ইলেক্ট্রোফোরসিস সনাক্তকরণ, 1% অ্যাগারোজ, 6V/সেমি, 15 মিনিট, 1-3 উল লোড হচ্ছে

নিউক্লিক অ্যাসিড পরিমাণগত বিশ্লেষণ
সাধারণত একটি UV স্পেকট্রোফটোমিটার ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়।আমাকে প্রথমে OD260, OD280 এবং OD230-এর তিনটি মানের অর্থ জনপ্রিয় করতে দিন।
·OD260nm: এটি নিউক্লিক অ্যাসিডের সর্বোচ্চ শোষণের শীর্ষের শোষণ তরঙ্গদৈর্ঘ্য, এবং সর্বোত্তম পরিমাপ করা মান 0.1 থেকে 1.0 পর্যন্ত।যদি না হয়, সীমার মধ্যে আনতে নমুনাটি পাতলা বা ঘনীভূত করুন।
·OD280nm: এটি প্রোটিন এবং ফেনোলিক পদার্থের সর্বোচ্চ শোষণের শীর্ষের শোষণ তরঙ্গদৈর্ঘ্য।
·OD230nm: এটি কার্বোহাইড্রেটের সর্বোচ্চ শোষণের শীর্ষের শোষণ তরঙ্গদৈর্ঘ্য।

এর পরে, আসুন প্রতিটি সূচকের ভূমিকা সম্পর্কে কথা বলি।A260 এর জন্য, এটি নিউক্লিক অ্যাসিডের ফলন পরিমাপ করতে ব্যবহার করা যেতে পারে।যখন OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

বিশুদ্ধতার জন্য, আমরা সাধারণত যে অনুপাত দেখি তা দেখতে হবে: OD260/280 এবং OD260/230৷
· বিশুদ্ধ ডিএনএ: OD260/280 প্রায় 1.8 এর সমান।যখন এটি 1.9-এর বেশি হয়, এটি নির্দেশ করে যে RNA দূষণ আছে, এবং যখন এটি 1.6-এর কম হয়, এটি নির্দেশ করে যে প্রোটিন এবং ফেনল দূষণ রয়েছে।
· বিশুদ্ধ আরএনএ: 1.7
·OD260/230: এটি DNA হোক বা RNA, রেফারেন্স মান হল 2.5।যখন এটি 2.0 এর কম হয়, এটি নির্দেশ করে যে চিনি, লবণ এবং জৈব পদার্থের দূষণ রয়েছে।

আরএনএ অখণ্ডতা

RNA এর অখণ্ডতা পরিমাপ করা খুবই গুরুত্বপূর্ণ।সাধারণত, 28S এবং 18S RNA এর মধ্যে উজ্জ্বলতা দ্বিগুণ সম্পর্ক কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য একটি RNA ডিনাচুরেশন জেল পরীক্ষা করা প্রয়োজন।যখন তৃতীয় ব্যান্ড 5S আবির্ভূত হয়, তখন এর মানে হল যে অমেরুদণ্ডী প্রাণী ছাড়া আরএনএ ক্ষয় হতে শুরু করেছে।

RNA গুণমান মূল্যায়নের জন্য ডেটা: উপরোক্ত পরীক্ষাগুলি ছাড়াও, RNA অখণ্ডতার পরিপ্রেক্ষিতে আরও কিছু উন্নত যন্ত্র পরীক্ষা রয়েছে, যেমন এক্সপেরিয়ন স্বয়ংক্রিয় ইলেক্ট্রোফোরেসিস সিস্টেমের RQI অখণ্ডতা পরীক্ষা, যা RNA অদৃশ্যভাবে অবনমিত হয়েছে কিনা তা সনাক্ত করতে পারে।

বৈজ্ঞানিক গবেষণায়, ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর লক্ষ্য জিন এবং অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিনের মধ্যে একটি তুলনা।অতএব, আরএনএ নমুনা সংরক্ষণ, আরএনএ নিষ্কাশন, ইত্যাদি প্রক্রিয়ায়, প্রাথমিক লক্ষ্য হল আরএনএর অখণ্ডতা নিশ্চিত করা।

কিভাবে RNA এর অখণ্ডতা লক্ষ্য জিন এবং অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিনের মধ্যে ভারসাম্যকে প্রভাবিত করে তা নীচের চিত্র থেকে সহজেই বোঝা যায়।অধঃপতন জিনের অসম্পূর্ণতার দিকে পরিচালিত করবে, এটি অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিনের অসম্পূর্ণতা বা লক্ষ্য জিনের অসম্পূর্ণতাই হোক না কেন, এটি ডেটার উপর একটি বড় প্রভাব ফেলবে।

লক্ষ্য জিন এবং রেফারেন্স জিনের পরিকল্পিত চিত্র, সত্য হতে হবে না

নিষেধাজ্ঞা পরীক্ষা (সিটি মান উচ্চ বা নিম্ন ঘনত্ব বা অন্যান্য অবস্থার অধীনে দমন করা হয় কিনা)

এই চিত্রটিকে উদাহরণ হিসাবে নিলে, পাঁচটি বক্ররেখার Ct মান নিম্নরূপ।বক্ররেখার মধ্যে CT মানগুলির বন্টন অসম, এবং Ct মানগুলি উচ্চ এবং নিম্ন ঘনত্বের অধীনে বিলম্বিত হয়, যা PCR বাধার ক্ষেত্রে।

মূল বিষয়: আরএনএ নিষ্কাশন প্রক্রিয়ায়, আমাদের ভুল ধারণা ত্যাগ করতে হবে এবং সঠিক ধারণাগুলি প্রতিষ্ঠা করতে হবে।

ভুল ধারণা হল: আরএনএ নিষ্কাশন শুধুমাত্র ফলনকে অনুসরণ করে, এই ভেবে যে RNA এর পরিমাণ যত বেশি পাওয়া যায় ততই ভালো।প্রকৃতপক্ষে, যখন আমরা পরিমাপ করি, যদি জিনের সংখ্যা খুব বেশি না হয়, তাহলে আমাদের বেশি আরএনএর প্রয়োজন নেই।আপনি যে পরিমাণ আরএনএ নিষ্কাশন করেন তার চেয়ে বেশি।

সঠিক ধারণা হল:RNA নিষ্কাশন বিশুদ্ধতা, অখণ্ডতা এবং ধারাবাহিকতা অনুসরণ করা উচিত.বিশুদ্ধতা নিশ্চিত করতে পারে যে পরবর্তী বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন বাধাগ্রস্ত হয় না এবং ডেটা DNA দ্বারা প্রভাবিত হবে না।সততা লক্ষ্য ক্রম এবং অভ্যন্তরীণ রেফারেন্সের ভারসাম্য নিশ্চিত করে।ধারাবাহিকতা স্থিতিশীল নমুনা লোডিং নিশ্চিত করে।

MIQE (4) - বিপরীত প্রতিলিপি
ভুল ধারণা: উচ্চ নমুনা ভলিউম সাধনা.
সঠিক ধারণা: সামঞ্জস্যতা (স্থায়িত্ব) অনুসরণ করুন, আরএনএ লোডের পরিমাণ নির্বিশেষে, বিপরীত ট্রান্সক্রিপশনের দক্ষতা সামঞ্জস্যপূর্ণ থাকে, নিশ্চিত করে যে সিডিএনএ-তে পার্থক্যগুলি সত্যই mRNA-তে পার্থক্য প্রতিফলিত করতে পারে।
আমরা একটি পরিকল্পিত চিত্রের সাথে এই প্রক্রিয়াটি ব্যাখ্যা করি:

বিপরীত প্রতিলিপি দক্ষতার পরিকল্পিত চিত্র, সত্য হবে না
প্রথমত, আমাদের রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন প্রক্রিয়া এবং পিসিআর প্রক্রিয়ার মধ্যে পার্থক্য বুঝতে হবে।পিসিআর একাধিক গরম এবং অ্যানিলিং প্রক্রিয়ার মধ্য দিয়ে যায়, এবং লক্ষ্য খণ্ডটি দ্রুত বৃদ্ধি পায়;রিভার্স ট্রান্সক্রিপশনে এই প্রক্রিয়া না থাকলেও, আমরা কল্পনা করতে পারি যে রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন আসলে এক থেকে এক হয় প্রতিলিপি প্রক্রিয়া চলাকালীন, যতগুলো টুকরো আরএনএ।

যেহেতু সিডিএনএ তথ্যের অনেকগুলি টুকরো পাওয়া যায়, এটি এখনই বোঝা উচিত, কারণ বড় এবং ছোট টুকরোগুলি বিপরীতভাবে প্রতিলিপি করা হয়েছে এবং একটি খণ্ডের উপর ফোকাস করা অসম্ভব।আর যেহেতু আরএনএর পরিমাণ তুলনামূলকভাবে কম, প্রাপ্ত সিডিএনএর পরিমাণও তুলনামূলকভাবে ছোট, পিসিআর থেকে ভিন্ন, যার একটি পরিবর্ধন প্রভাব রয়েছে, তাই এটি সনাক্ত করা মূলত অসম্ভব।

সিডিএনএ ইলেক্ট্রোফোরেসিস ফলাফল
দ্বিতীয়ত, আদর্শভাবে, রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন ওয়ান টু ওয়ান সঞ্চালিত হয়, কিন্তু কোনো কোম্পানির থেকে কোনো রিভার্স ট্রান্সক্রিপস এই প্রভাব অর্জন করতে পারে না।মূলত, বেশিরভাগ বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেসের কার্যকারিতা 30-50% এর মধ্যে ঘুরে বেড়ায়।যদি এটি হয়, তবে আমরা বরং একটি অপেক্ষাকৃত স্থিতিশীল বিপরীত প্রতিলিপি দক্ষতা থাকতে চাই, যা আমরা চিত্রটিতে দেখতে চাই: 3টি RNA 2টি cDNA পায়, 6টি RNA 4টি cDNA পায়, তাই যতই নমুনা লোড করা হোক না কেন, বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন দক্ষতা তুলনামূলকভাবে স্থিতিশীল।আমরা এমন পরিস্থিতি দেখতে চাই না যেখানে বিপরীত প্রতিলিপি দক্ষতা অস্থির এবং উচ্চ ঘনত্ব বাধাগ্রস্ত হয়।

সুতরাং, বিপরীত প্রতিলিপি দক্ষতা স্থিতিশীল কিনা তা যাচাই করবেন কিভাবে?পদ্ধতিটি খুবই সহজ, আপনাকে শুধুমাত্র একটি তুলনামূলক পরীক্ষা করতে হবে: একটি হল RNA-এর দ্বিগুণ তরলীকরণের পরে cDNA-তে প্রতিলিপি করা এবং অন্যটি হল cDNA-তে বিপরীত প্রতিলিপি করার পরে দ্বিগুণ তরলীকরণ করা, এবং তারপর প্রাপ্ত ঢাল দেখতে qPCR করতে হবে এটি সামঞ্জস্যপূর্ণ কিনা।একজন শীর্ষ ছাত্র হিসাবে, আপনার এটি সেকেন্ডের মধ্যে বোঝা উচিত।নিচে দেখানো হয়েছে:

রিভার্স ট্রান্সক্রিপশনের কার্যকারিতা স্থিতিশীল কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য RNA এবং cDNA এর তরলীকরণ
বিপরীত প্রতিলিপি এবং কিট
কিভাবে নিখুঁত ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত PCR চমৎকার বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজ এবং কিট আছে.রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজকে উৎস অনুসারে মোটামুটিভাবে দুই ভাগে ভাগ করা হয়েছে, এএমভি বাএম-এমএলভি, এবং তাদের কর্মক্ষমতা টেবিলে দেখানো হিসাবে একই.

RNase H কার্যকলাপ
RNase H হল Ribonuclease H, চাইনিজ নাম হল ribonuclease H, যা একটি এন্ডোরিবোনুক্লিজ যা DNA-RNA হাইব্রিড চেইনে RNA কে বিশেষভাবে হাইড্রোলাইজ করতে পারে।RNase H একক-স্ট্রেন্ডেড বা ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ বা আরএনএ-তে ফসফোডিস্টার বন্ডগুলিকে হাইড্রোলাইজ করতে পারে না, অর্থাৎ এটি একক-স্ট্র্যান্ডেড বা ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ বা আরএনএ হজম করতে পারে না।সাধারণত সিডিএনএর দ্বিতীয় স্ট্র্যান্ডের সংশ্লেষণে ব্যবহৃত হয়।

এটা একটা অদ্ভুত ব্যাপার।আমরা বলি যে রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজে RNase H কার্যকলাপ আছে, এমন নয় যে বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেসে RNase H রয়েছে, এবং RNase H কে রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ থেকে আলাদা করা সম্ভব নাও হতে পারে, সম্ভবত রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজে নির্দিষ্ট গ্রুপের গঠনের কারণে এই কার্যকলাপটি বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজের কারণে ঘটে।

অতএব, AMV-এর উচ্চতর বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন দক্ষতা নির্বিশেষে, এর RNase H কার্যকলাপ cDNA এর ফলন কমিয়ে দেয়।অবশ্যই, রিএজেন্ট নির্মাতারা ক্রমাগত তাদের পণ্যগুলিকে অপ্টিমাইজ করে থাকে যাতে সিডিএনএ-এর ফলন বাড়ানোর জন্য যতটা সম্ভব বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজে RNase H কার্যকলাপ দূর করা যায়।
অ্যানিলিং তাপমাত্রা

বিভিন্ন তাপমাত্রায় RNA এর সেকেন্ডারি গঠন
বিভিন্ন তাপমাত্রায় RNA-এর গৌণ কাঠামোর জন্য উপরের চিত্রটি দেখুন এবং নির্দিষ্ট তাপমাত্রা এবং লবণের ঘনত্বের অবস্থার অধীনে লক্ষ্য খণ্ডের গৌণ কাঠামো নির্ধারণ করতে mFold অনলাইন টুল ব্যবহার করুন।55°C এ, RNA-এর সেকেন্ডারি স্ট্রাকচার এখনও খুব জটিল, বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেস কাজ করতে পারে না, এবং 65°C পর্যন্ত সেকেন্ডারি স্ট্রাকচার সম্পূর্ণভাবে সমাধান করা যায় না, যখন AMV এবং M-MLV-এর সর্বোত্তম তাপমাত্রা এই তাপমাত্রার থেকে অনেক কম।
কি করো?সেকেন্ডারি স্ট্রাকচার হল টেমপ্লেটের পরিপূরক জোড়া, যা প্রাইমার এবং রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ এবং টেমপ্লেটের মধ্যে শক্তিশালী প্রতিযোগিতার দিকে পরিচালিত করে, যার ফলে কম E এবং দুর্বল পুনরাবৃত্তিযোগ্যতার মতো সমস্যাগুলির একটি সিরিজ হয়।

কি করো?শুধুমাত্র যতটা সম্ভব অ্যানিলিং তাপমাত্রা বাড়ান।

অনেক রিএজেন্ট নির্মাতারা জেনেটিক ইঞ্জিনিয়ারিংয়ের মাধ্যমে তাদের বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেস উন্নত করছে।কিছু প্রতিক্রিয়া তাপমাত্রা বাড়ায়, যেমন জিফান এবং আইডেলাই, এবং কিছু এনজাইম এবং আরএনএ টেমপ্লেটের মধ্যে সম্পর্ক উন্নত করতে RNase H এনজাইমের সক্রিয় গ্রুপকে সরিয়ে দেয়।উচ্চ সখ্যতা প্রতিযোগিতামূলকভাবে গৌণ কাঠামোকে চেপে দিতে পারে এবং মসৃণভাবে পড়তে পারে এবং বিপরীত প্রতিলিপির দক্ষতাকেও ব্যাপকভাবে উন্নত করতে পারে।
মূল পয়েন্ট: বিপরীত প্রতিলিপি দক্ষতার সামঞ্জস্য বজায় রাখার জন্য বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন আরও গুরুত্বপূর্ণ (এনজাইমগুলি কেবলমাত্র দক্ষই নয় বরং স্থিতিশীলও হতে হবে), নমুনা লোডের পরিমাণের পরিবর্তে, যদি এটি একটি বিশেষভাবে বড় আকারের ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত PCR না হয় তবে এটি মোটেও সম্ভব হবে না।একাধিক সিডিএনএ।
বিভিন্ন নির্মাতারা ধারাবাহিকতার অন্বেষণে কিছু প্রচেষ্টাও করেছেন।উদাহরণস্বরূপ, বেশিরভাগ সংস্থাগুলি এখন বিক্রির জন্য একটি মানক কিট হিসাবে বিপরীত প্রতিলিপি প্যাকেজ করেছে, যা একটি ভাল পছন্দ।
উদাহরণস্বরূপ, ফোরজিনের আরটি ইজি সিরিজ কিটস:

আরটি ইজি আই (প্রথম স্ট্র্যান্ড সিডিএনএ সংশ্লেষণ কিটের জন্য মাস্টার প্রিমিক্স)

MIQE (5) - লক্ষ্য জিনের তথ্য

উপরের চিত্রটি ব্যাখ্যা করে
1. এই জিনটি বারবার পরীক্ষার জন্য কার্যকর কিনা তা সাধারণত বারবার পরীক্ষার মাধ্যমে যাচাই করা যায়।
2. জিন আইডি, আপনি জানেন.
3. জিনের দৈর্ঘ্য, টার্গেট জিনের মোট দৈর্ঘ্য নিশ্চিতভাবে কোন সমস্যা নেই।প্রাইমার ডিজাইন করার সময়, নিশ্চিত করুন যে অ্যামপ্লিকনের দৈর্ঘ্য 80-200bp এর মধ্যে হয় যাতে আরও ভাল পরিবর্ধন দক্ষতা নিশ্চিত করা যায়।
4. সিকোয়েন্স ব্লাস্ট তুলনা তথ্য, অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন রোধ করতে জিনব্যাঙ্কে লক্ষ্য জিনের তুলনা করা দরকার।
5. সিউডোজিনের উপস্থিতি।একটি সিউডোজিন হল একটি ডিএনএ সিকোয়েন্স যা একটি সাধারণ জিনের অনুরূপ কিন্তু তার স্বাভাবিক কার্যকারিতা হারায়।এটি প্রায়শই ইউক্যারিওটের মাল্টি-জিন পরিবারে বিদ্যমান।এটি সাধারণত ψ দ্বারা প্রতিনিধিত্ব করা হয়।এটি জিনোমের একটি নন-ফাংশনাল জিনোমিক ডিএনএ কপি যা কোডিং জিন সিকোয়েন্সের অনুরূপ।, সাধারণত প্রতিলিপি করা হয় না এবং এর কোন স্পষ্ট শারীরবৃত্তীয় অর্থ নেই।
6. এক্সন এবং ইন্ট্রোনের সাপেক্ষে প্রাইমারের অবস্থান।প্রারম্ভিক বছরগুলিতে, যখন আমরা ডিএনএ দূষণের সমস্যা সমাধান করেছি, আমরা প্রায়ই প্রাইমার, এক্সন এবং ইন্ট্রোনের অবস্থানের দিকে মনোযোগ দিতাম এবং সাধারণত ডিএনএ পরিবর্ধন এড়াতে ইন্ট্রোন জুড়ে প্রাইমার ডিজাইন করার কথা বিবেচনা করতাম।অনুগ্রহ করে নীচের চিত্রটি দেখুন: কালো ইন্ট্রোনকে প্রতিনিধিত্ব করে, বিভিন্ন ব্লুজ এক্সনকে প্রতিনিধিত্ব করে, গোলাপী সাধারণ প্রাইমারগুলিকে প্রতিনিধিত্ব করে এবং উজ্জ্বল লাল ইন্ট্রন-স্প্যানিং প্রাইমারকে প্রতিনিধিত্ব করে।

পরিকল্পিত, কখনও সত্য
এটি কি একটি নিখুঁত পরিকল্পনা বলে মনে হচ্ছে, কিন্তু বাস্তবে, বেশিরভাগ ক্ষেত্রে, ট্রান্স-ইন্ট্রন প্রাইমারগুলি কল্পনার মতো জাদুকর নয় এবং তারা অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনও ঘটাবে।তাই ডিএনএ দূষণ প্রতিরোধের সর্বোত্তম উপায় হল ডিএনএ সম্পূর্ণরূপে অপসারণ করা।
7. গঠনের পূর্বাভাস।এই উদাহরণটি আবার ব্যবহার করে, একটি নির্দিষ্ট তাপমাত্রা এবং লবণের ঘনত্বে লক্ষ্য খণ্ডের গৌণ কাঠামো নির্ধারণ করতে mFold অনলাইন টুল ব্যবহার করুন।

বিভিন্ন তাপমাত্রায় RNA এর সেকেন্ডারি গঠন
সেকেন্ডারি স্ট্রাকচার হল টেমপ্লেটেরই পরিপূরক জোড়া, যা প্রাইমার এবং টেমপ্লেট জোড়ার মধ্যে শক্তিশালী প্রতিযোগিতার দিকে নিয়ে যাবে এবং প্রাইমার বাঁধার সম্ভাবনা কম, ফলে কম E এবং দুর্বল পুনরাবৃত্তিযোগ্যতার মতো সমস্যাগুলির একটি সিরিজ তৈরি হয়।সফ্টওয়্যার ভবিষ্যদ্বাণীর মাধ্যমে, যদি কোনও সেকেন্ডারি স্ট্রাকচার সমস্যা না থাকে তবে এটি দুর্দান্ত হবে।যদি থাকে, আমাদের ফলো-আপ নিবন্ধটি বিশেষভাবে আলোচনা করবে কিভাবে এই সমস্যাটি সমাধান করা যায়।

MIQE (6)-qPCR অলিগোনিউক্লিওটাইডস

ফ্লুরোসেন্ট কোয়ান্টিটেটিভ পিসিআর-এর জন্য, প্রথম যে জিনিসটির সাথে আপনি প্রতিদিন লড়াই করেন তা হল আরএনএ নিষ্কাশন, এবং দ্বিতীয় জিনিসটি প্রাইমার ডিজাইন হতে পারে।
প্রথমত, আমরা এখনও MIQE চেকলিস্ট অনুসারে প্রাইমার ডিজাইনের নিয়মগুলি পরীক্ষা করি।এটা এত সহজ যে স্ক্যামব্যাগরা হাসতে পারে, এবং আমরা এটি একটি বাক্যে শেষ করতে পারি: প্রাইমার প্রোবের ক্রম এবং অবস্থান এবং পরিবর্তন পদ্ধতি খুঁজে বের করুন।প্রাইমার বিশুদ্ধকরণ পদ্ধতির জন্য, প্রাইমার সংশ্লেষণ বর্তমানে এত সস্তা, কিউপিসিআর PAGE এবং উপরের পরিশোধন পদ্ধতির যোগ্য, এবং সংশ্লেষণ যন্ত্রের তথ্য গুরুত্বপূর্ণ নয়।অনেকে কয়েক দশক ধরে প্রাইমার করছেন এবং জানেন না যে সিন্থেসাইজারটি ABI3900।
প্রাইমার ডিজাইনের নীতিগুলি সম্পর্কে, আপনাকে সেগুলি রোটে মনে রাখতে হবে না, কারণ বেশিরভাগ প্রাইমার ডিজাইন সফ্টওয়্যার বা অনলাইন টুল এই সমস্যাগুলির যত্ন নিতে পারে (প্রস্তাবিত অনলাইন টুল primer3.ut.ee/), এবং প্রাইমার ডিজাইনের 99.999% ম্যানুয়ালি করা হয় না দেখুন, লেখক কখনও কখনও দিনে শত শত প্রাইমার ডিজাইন করেন, যদি আপনি এটি একের পর এক ক্রস করে ফেলেন।
প্রাইমারগুলি ডিজাইন করার পরে শুধুমাত্র নিম্নলিখিত পয়েন্টগুলি পরীক্ষা করুন:
1. 3′ প্রান্তের কাছাকাছি প্রাইমার ডিজাইন করুন: সিডিএনএ ফার্স্ট-স্ট্র্যান্ড সংশ্লেষণের জন্য অলিগো ডিটি প্রাইমার ব্যবহার করার ক্ষেত্রে, বিপরীত প্রতিলিপি দক্ষতা এবং আরএনএ অখণ্ডতা বিবেচনা করে, পরিবর্ধন দক্ষতা উন্নত করার জন্য ডিজাইন করা প্রাইমারগুলি 3′ প্রান্তের কাছাকাছি ডিজাইন করা প্রয়োজন।নিম্নরূপ ব্যাখ্যা করার জন্য একটি ছবি ব্যবহার করুন (এটি বোঝার কোন উপায় নেই):

কেন প্রাইমারগুলি 3′ প্রান্তের কাছাকাছি ডিজাইন করা উচিত, এটি সত্য হতে হবে না
2. TM মান: Tm মান হল 55-65°C (কারণ exonuclease কার্যকলাপ সর্বোচ্চ 60°C) এবং GC বিষয়বস্তু 40%-60%।
3. ব্লাস্ট: জিনোমের অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন এড়াতে, পরিপূরক যাচাইয়ের জন্য ব্লাস্ট ব্যবহার করতে হবে।

MIQE(7)-qPCR প্রক্রিয়া

1. qPCR কিট
MIQE-এর প্রয়োজনীয়তা অনুসারে, PCR প্রতিক্রিয়া সিস্টেমের কনফিগারেশন, কোন কিট ব্যবহার করা হয়, কে প্রস্তুতকারক, প্রতিক্রিয়া সিস্টেমটি কত বড়, রঞ্জক পদ্ধতি বা প্রোব পদ্ধতি ব্যবহার করা হয় কিনা, PCR প্রোগ্রাম সেটিংস সহ নিবন্ধে আমাদের সম্পূর্ণ প্রতিক্রিয়া অবস্থাগুলি স্পষ্টভাবে বর্ণনা করতে হবে।অভিজ্ঞ ড্রাইভাররা নিশ্চিতভাবে দেখতে পাবেন যে যতক্ষণ পর্যন্ত কিটটি নির্বাচন করা হয়, উপরের তথ্যগুলি মূলত নির্ধারিত হয়।
বর্তমানে, ফ্লুরোসেন্ট কোয়ান্টিটেটিভ পিসিআর কিট তৈরি ও উৎপাদন একটি অত্যন্ত পরিপক্ক প্রযুক্তি।যতক্ষণ না আপনি অত্যন্ত খারাপ নির্মাতাদের বেছে না নেন, ততক্ষণ সমস্যা হওয়ার সম্ভাবনা বেশি নয়, তবে আমরা এখনও আপনার সাথে কয়েকটি পয়েন্ট শেয়ার করতে চাই:
হট-স্টার্ট টাক এনজাইম:PCR-এর সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ অংশ হট-স্টার্ট Taq এনজাইম।বাজারে হট-স্টার্ট এনজাইমগুলি সাধারণত দুই প্রকারে বিভক্ত, একটি রাসায়নিকভাবে পরিবর্তিত হট-স্টার্ট এনজাইম (আপনি এটিকে প্যারাফিন এম্বেডিং হিসাবে কল্পনা করতে পারেন), এবং অন্যটি হল অ্যান্টিবডি পরিবর্তনের জন্য একটি হট-স্টার্ট এনজাইম (এন্টিজেন-অ্যান্টিবডি বাইন্ডিং)।রাসায়নিক পরিবর্তন হট-স্টার্টিং এনজাইমগুলির একটি প্রাথমিক উপায়।একটি নির্দিষ্ট তাপমাত্রায় পৌঁছে গেলে, এনজাইমটি তার কার্যকলাপ ছেড়ে দেবে।অ্যান্টিবডি-সংশোধিত হট-স্টার্ট এনজাইম এনজাইমের কার্যকলাপকে ব্লক করতে জৈবিক পদ্ধতি ব্যবহার করে।একটি নির্দিষ্ট তাপমাত্রায় পৌঁছে গেলে, অ্যান্টিবডিটি বিকৃত হয়ে যাবে এবং প্রোটিন হিসাবে নিষ্ক্রিয় হয়ে যাবে এবং এনজাইমের ক্রিয়াকলাপ কার্যকর হবে।

যাইহোক, এই লাভ কি?এই ক্ষেত্রে, অ্যান্টিবডি-সংশোধিত এনজাইমগুলির মুক্তির কার্যকলাপ রাসায়নিকভাবে পরিবর্তিত এনজাইমের তুলনায় দ্রুত, তাই সংবেদনশীলতার পরিপ্রেক্ষিতে, অ্যান্টিবডি-সংশোধিত এনজাইমগুলির একটি সামান্য সুবিধা রয়েছে, যাতে বাজারে কিটগুলিতে মূলত কোনও রাসায়নিকভাবে পরিবর্তিত এনজাইম নেই।যদি থাকে, তাহলে এই নির্মাতার প্রযুক্তি এখনও সহস্রাব্দের যুগে আটকে আছে।
ম্যাগনেসিয়াম আয়ন ঘনত্ব:পিসিআর বিক্রিয়ায় ম্যাগনেসিয়াম আয়নের ঘনত্ব খুবই গুরুত্বপূর্ণ।উপযুক্ত ম্যাগনেসিয়াম আয়ন ঘনত্ব Taq এনজাইমের ক্রিয়াকলাপকে উন্নীত করতে পারে।ঘনত্ব খুব কম হলে, এনজাইম কার্যকলাপ উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করা হবে;ঘনত্ব খুব বেশি হলে, এনজাইম-অনুঘটক অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন উন্নত করা হবে।ম্যাগনেসিয়াম আয়নগুলির ঘনত্ব প্রাইমারগুলির অ্যানিলিংকেও প্রভাবিত করবে, টেমপ্লেটের গলিত তাপমাত্রা এবং পিসিআর পণ্যগুলিকে প্রভাবিত করবে, যার ফলে পরিবর্ধিত টুকরোগুলির ফলনকে প্রভাবিত করবে।ম্যাগনেসিয়াম আয়নগুলির ঘনত্ব সাধারণত 25 মিমি এ নিয়ন্ত্রিত হয়।অবশ্যই, একটি ভাল কিটের জন্য, ম্যাগনেসিয়াম আয়নগুলির ঘনত্ব ভালভাবে নিয়ন্ত্রণ করতে হবে।কিছু ব্যবসায়ী রিএজেন্টে একটি ম্যাগনেসিয়াম আয়ন চেলেটিং এজেন্ট যোগ করে, যা ম্যাগনেসিয়াম আয়ন ঘনত্বের স্বয়ংক্রিয় সমন্বয়ের প্রভাব অর্জন করতে পারে।
ফ্লুরোসেন্ট ডাই ঘনত্ব:ফ্লুরোসেন্ট ডাই, যা আমরা সাধারণত ব্যবহার করি এসওয়াইবিআর গ্রিন, মূলত ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ-র ছোট খাঁজের সাথে আবদ্ধ হয়ে ফ্লুরোসেন্স তৈরি করে, কারণ ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ-তে ডাই-এর বাঁধন অ-নির্দিষ্ট, অর্থাৎ যতক্ষণ পর্যন্ত ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ হয়, ততক্ষণ পর্যন্ত এটি ডিএনএ-এর সাথে মিলিত হতে পারে, তাই ফ্লুরোসেন্ট ফ্লুরোসেন্স তৈরি করতে পারে। সিস্টেমটি এটির সাথে একত্রিত হয়ে একটি পটভূমি সংকেত তৈরি করবে।
PS: এর আলো-সংবেদনশীল বৈশিষ্ট্যের কারণে, বাজারে পণ্যগুলি সাধারণত বাদামী অস্বচ্ছ সেন্ট্রিফিউজ টিউবে প্যাকেজ করা হয় (নিচের ছবিতে দেখানো হয়েছে)।যাইহোক, এটি একটি সমস্যার সম্মুখীন হবে.নমুনা নেওয়ার সময় তরলটি চুষে নেওয়া হয় কিনা তা দেখা কঠিন।এই ক্ষেত্রে, কিংকে প্রকৃতপক্ষে সবচেয়ে ব্যবহারকারী-বান্ধব (নীচের ছবিতে দেখানো হয়েছে), এবং স্বচ্ছ টিউবটি একটি অস্বচ্ছ টিনের ব্যাগে প্যাকেজ করা হয়।তারপরে এটি একটি টিনের ব্যাগে রাখুন, আলো এড়াতে এবং নমুনা নেওয়ার সুবিধার কথা বিবেচনা করে।আপনি সঠিক পণ্য নম্বর চয়ন করতে হবে.TSE204 একটি অতি ব্যয়-কার্যকর অস্তিত্ব, যা আমাকে ঘাস লাগাতে চায়।

ফ্লুরোসেন্ট ডাই এর ঘনত্বও খুব গুরুত্বপূর্ণ।ঘনত্ব খুব কম হলে, পরিবর্ধন বক্ররেখা পরবর্তী পর্যায়ে উপরে যাবে না এবং নিখুঁত হবে না;ঘনত্ব খুব বেশি হলে, এটি শব্দ হস্তক্ষেপের কারণ হবে।যেহেতু ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর প্রধানত সিটি মানের উপর নির্ভর করে, যদি ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জকের ঘনত্ব সঠিকভাবে সামঞ্জস্য না করা হয় তবে নিম্ন বিন্দু উচ্চ বিন্দুর চেয়ে ভাল।অবশ্যই, উপযুক্ত ছোপানো ঘনত্ব সর্বোত্তম।

ROX: ROX রঞ্জকগুলি ভাল-টু-ওয়েল ফ্লুরোসেন্স সংকেত ত্রুটিগুলি সংশোধন করতে ব্যবহৃত হয়।কিছু যন্ত্র প্রস্তুতকারকের ক্রমাঙ্কন প্রয়োজন, অন্যরা তা করে না।উদাহরণস্বরূপ, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিকের রিয়েল টাইম পিসিআর অ্যামপ্লিফিকেশন যন্ত্রের ব্যবহারে সাধারণত 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, ইত্যাদি সহ ক্রমাঙ্কন প্রয়োজন। সাধারণ কিট নির্দেশাবলী এটি বর্ণনা করবে।
Foregene এর qPCR মিক্সে ROX ডাইও রয়েছে, যা বিভিন্ন মডেলে ব্যবহারের জন্য সুবিধাজনক।

রিয়েল টাইম পিসিআর কিট-তাকমান

দুর্বল হাইড্রোজেন বন্ড চিকিত্সা: দুর্বল হাইড্রোজেন বন্ডের চিকিৎসা তুলনামূলকভাবে প্রযুক্তিগত ব্যাপার।অনেক কিটের ম্যানুয়াল কিছুই পড়েনি, কিন্তু তাদের কেউই এই বিষয়টি উল্লেখ করেনি।আসলে, এটা তাই গুরুত্বপূর্ণ.ঘাঁটিগুলির সংমিশ্রণ প্রধানত হাইড্রোজেন বন্ধনের শক্তির উপর নির্ভর করে।শক্তিশালী হাইড্রোজেন বন্ধন স্বাভাবিক পরিবর্ধন, এবং দুর্বল হাইড্রোজেন বন্ধন অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনের দিকে পরিচালিত করে।দুর্বল হাইড্রোজেন বন্ধন ভালভাবে নির্মূল করা না গেলে, অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন এড়ানো যাবে না।লেখকের সুযোগের মধ্যে, শুধুমাত্র কয়েকটি কোম্পানি এই সমস্যাটি লক্ষ্য করেছে।আপনি যখন কিটটি কিনবেন, আপনি যে কিটটি বেছে নিতে চান তার জন্য আপনি এই বিষয়ে একটি সমাধান বিবেচনা করেছেন কিনা তা উল্লেখ করতে পারেন।

প্রতিক্রিয়া ভলিউম: 20-50ul সিস্টেম বেশি ব্যবহৃত হয়, এবং ছোট ভলিউম ত্রুটির কারণ হতে পারে।সাধারণভাবে বলতে গেলে, কিট নির্দেশাবলী পিসিআর প্রতিক্রিয়া ভলিউম ব্যবহারের সুপারিশ করবে।স্মার্ট হবেন না এবং খরচ বাঁচাতে ছোট ভলিউম ব্যবহার করুন।এর লক্ষ্য।বণিকদের দ্বারা প্রস্তাবিত ভলিউম আসলে পরীক্ষা করা হয়েছে, এবং এটা হতে পারে যে তারা ছোট ভলিউমের কারণে সৃষ্ট ত্রুটির সমস্যা সমাধান করতে পারে না।
2. টিউব প্লেটের প্রস্তুতকারক এবং নিবন্ধ নম্বর
প্রত্যেকেই ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর নীতিটি জানে।ফ্লুরোসেন্স সংগ্রহ প্রধানত পিসিআর টিউব ক্যাপের মাধ্যমে বাহিত হয়।পিসিআর ভোগ্যপণ্য নির্বাচন করার সময়, দুটি পয়েন্টে মনোযোগ দিন: ভাল আলো সংক্রমণ এবং যন্ত্রের জন্য উপযুক্ত।সাধারণভাবে বলতে গেলে, মূলধারার ব্র্যান্ডের বোর্ড এবং টিউবগুলি ঠিক আছে, তবে আপনাকে অভিযোজনের ক্ষেত্রে সাবধানে বেছে নিতে হবে, অন্যথায় আপনি যন্ত্রটি ব্যবহার করতে পারবেন না।

4. শীর্ষ স্তরের জ্ঞান

MIQE (8)-qPCR বৈধতা
এটি qPCR এর সর্বোচ্চ অগ্রাধিকার!এত নায়ক এখানে বালিতে পড়েছে।অবশ্যই, এটাও সম্ভব যে আপনি ভাগ্যবান এবং আপনি যে জিনগুলি অধ্যয়ন করেছেন তা সহজ, তাই আপনি বাতাসের সাথে বরফের গুহার মধ্য দিয়ে ভেসেছেন।qPCR-এর যাচাইকরণের তথ্য ডেটার নির্ভরযোগ্যতা পরীক্ষা করার উদ্দেশ্যে।আমরা নিম্নলিখিত হিসাবে প্রয়োজনীয় যাচাইকরণ তথ্য তালিকাভুক্ত করি:

1. নির্দিষ্টতা পরীক্ষা
ইলেক্ট্রোফোরেসিস ছবি একটি একক ব্যান্ড কিনা তা পরীক্ষা করে লক্ষ্য জিন পরিবর্ধনের নির্দিষ্টতা পরীক্ষা করা হয়;সিকোয়েন্সিং যাচাইকরণ;পিক ম্যাপ একক কিনা তা দেখতে গলিত বক্ররেখা;এনজাইম হজম যাচাইকরণ এবং অন্যান্য পদ্ধতি।
এখানে, আমরা টি ফোকাসতিনি বক্ররেখা গলানোর পদ্ধতি ব্যবহার করে অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনের বিশ্লেষণ করেন.সাধারণভাবে বলতে গেলে, যখন আমরা প্রাইমার ডিজাইন করি, তখন পণ্যের খণ্ডের আকার 80-200bp-এর মধ্যে হওয়া প্রয়োজন, যা PCR পণ্যের গলিত তাপমাত্রা 80-85 °C রেঞ্জে পরিণত করে।অতএব, যদি বিবিধ চূড়া থাকে, তবে অবশ্যই অন্যান্য অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন পণ্য থাকতে হবে;যদি শিখরটি 80 ডিগ্রি সেলসিয়াসের নীচে প্রদর্শিত হয় তবে এটি সাধারণত একটি প্রাইমার ডাইমার হিসাবে বিবেচিত হয়;যদি শিখরটি 85 ডিগ্রি সেলসিয়াসের উপরে দেখা যায়, তবে এটি সাধারণত ডিএনএ দূষণ বা বড় টুকরোগুলির আরও অনির্দিষ্ট পরিবর্ধন হিসাবে বিবেচিত হয়।
দ্রষ্টব্য: কখনও কখনও 80 ডিগ্রি সেলসিয়াসে শুধুমাত্র একটি পিক থাকে।এই সময়ে, এই ধারণাটি অবশ্যই মেনে চলতে হবে।এটা সম্ভবত যে পরিবর্ধন ফলাফল সব প্রাইমার dimers.

সাধারণ গলে যাওয়া বক্ররেখা (কোন অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন ছাড়াই একক শিখর)

সমস্যাযুক্ত গলে যাওয়া বক্ররেখা (অ-নির্দিষ্ট প্রশস্তিকরণের নকল শিখর)
【কেস বিশ্লেষণ】

একটি প্রধান শিখর আছে, কিন্তু প্রাইমার ডাইমার গুরুতর
নীচের চিত্রে একক-পিক গলে যাওয়া বক্ররেখা সহজেই আপনার চোখকে প্রতারণা করতে পারে, ভাবতে পারে এটি একটি নিখুঁত পরীক্ষা, কিন্তু ফলাফল সম্পূর্ণ ভুল।এই সময়ে, আমাদের গলানো তাপমাত্রার দিকে তাকাতে হবে।সর্বোচ্চ তাপমাত্রা 80°C এর নিচে, যা সম্পূর্ণ প্রাইমার-ডাইমার।

কোন টার্গেট ফ্র্যাগমেন্ট নেই, সব প্রাইমার ডাইমার
এখানে, আমার ভাই থামতে পারবেন না।নিচের ছবিটি একটি মোবাইল ফোনের মাধ্যমে তোলা একটি ছবি যা একজন বদমাশ আমাকে পাঠিয়েছে।তিনি যে রিএজেন্টগুলি ব্যবহার করেছেন সেগুলি শিল্পে সাধারণভাবে ব্যবহৃত ব্র্যান্ড।তিনি একটি টি-প্রিফিক্স ব্র্যান্ড থেকে অন্য টি-প্রিফিক্স ব্র্যান্ডে পরিবর্তিত হয়েছেন।আমি মনে করি আপনি ইতিমধ্যে এটি অনুমান করেছেন.স্ক্যামব্যাগ আমাকে চিৎকার করে বলেছিল: “প্রথম ছবিতে ব্যবহৃত বিকারকটি খুব ভাল, এবং শিখরটি একক।পরে, আপনার প্রস্তাবিত বিকারক ব্যবহার করার পরে, এটি মিশ্র শিখর সহ দ্বিতীয় ছবির মতো হয়ে যায়।তুমি আমাকে অসহায় করেছ।"
দুটি গ্রাফ আলাদা করুন।প্রথম নজরে, একটির একটি একক শিখর রয়েছে এবং অন্যটির একটি দ্বিগুণ শিখর রয়েছে৷আজেবাজে কথা, একক পিক অবশ্যই ভালো।এটা কি সত্যি?
ডু ই এর চেয়েও খারাপ, নিচের ছবিতে দুটো ছবি দিলেই বুঝতে পারবেন।আসলে এই ধরনের ছবি দেখে আমরা সহজেই পঙ্গু হয়ে যাই।সতর্কতার সাথে বিশ্লেষণ করার পরে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে: প্রথম চিত্রের শিখরটি 75°C, যা সম্পূর্ণরূপে প্রাইমার ডাইমার;দ্বিতীয় চিত্রের শিখরটি 75°C এবং 82°C এ উপস্থিত হয়, অন্তত সেখানে পণ্যটি উপস্থিত হয়।

শিক্ষার্থীদের কাছ থেকে প্রতিক্রিয়ার ছবি
তাই মৌলিক সমস্যা রিএজেন্টের সমস্যা নয়, প্রাইমার ডিজাইনের সমস্যা।একই সময়ে, এটিও প্রমাণ করে যে কিছু বড় ব্র্যান্ড লোহার মানের নয়, এবং এটিও প্রমাণ করে যে আমার ভাই আগে যা বলেছিলেন: এটি রিএজেন্ট ব্র্যান্ড নয় যা আপনার নিবন্ধটিকে সমর্থন করে।এটি আপনার নিবন্ধ যা বিকারক ব্র্যান্ড আপ propped.শুধু কল্পনা করুন, স্কামব্যাগ যদি রিএজেন্টগুলি পরিবর্তন না করে, তবে ভুল ডেটা জার্নালে পাঠানো হবে এবং যা ঘটবে তা একটি ট্র্যাজেডি হবে।
2. ফাঁকা নিয়ন্ত্রণের Ct মান
ব্যাখ্যা করবেন না, যদি ফাঁকা নিয়ন্ত্রণের একটি Ct মান থাকে তবে এটি কি দূষণ নয়?যাইহোক, আপনাকে এখনও বুঝতে হবে কোন ফাঁকা নিয়ন্ত্রণের একটি Ct মান রয়েছে।যদি এটি এনটিসি হয়, তাহলে এর মানে বিদেশী ডিএনএ যেমন বিকারক দূষণ আছে।যদি এটি এনআরটি হয়, তাহলে এর অর্থ হল নিষ্কাশিত আরএনএ-তে ডিএনএ দূষণ রয়েছে।
3. স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখা
ঢাল এবং গণনার সূত্র সহ, PCR দক্ষতা সূত্রের মাধ্যমে গণনা করা যেতে পারে।একটি নিখুঁত পরীক্ষার জন্য স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখার ঢাল 3.32-এর কাছে যেতে হবে এবং R² 0.9999-এর কাছে যেতে হবে।
4. রৈখিক গতিশীল পরিসীমা
প্রতিক্রিয়ার গতিশীল পরিসীমা রৈখিক।স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখা তৈরি করতে ব্যবহৃত টেমপ্লেট অনুসারে, গতিশীল পরিসরে কমপক্ষে 5টি ঘনত্ব গ্রেডিয়েন্ট অন্তর্ভুক্ত করা উচিত এবং উচ্চ ঘনত্ব গ্রেডিয়েন্ট এবং কম ঘনত্ব গ্রেডিয়েন্টে Ct মান পরিবর্তনের দিকে মনোযোগ দেওয়া উচিত।
5. সনাক্তকরণ নির্ভুলতা
qPCR ফলাফলে পরিবর্তন, অর্থাৎ, দুর্বল পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা, অর্থাৎ দুর্বল নির্ভুলতা, তাপমাত্রা, ঘনত্ব এবং অপারেশন সহ অনেক কারণের কারণে ঘটে।qPCR নির্ভুলতা সাধারণত কম নিয়ন্ত্রণযোগ্য হয়ে ওঠে কারণ অনুলিপি সংখ্যা হ্রাস পায়।আদর্শভাবে পরীক্ষামূলক প্রকরণের মধ্যে, এই প্রযুক্তিগত বৈচিত্রটি জৈবিক প্রকরণ থেকে আলাদা হওয়া উচিত, এবং জৈবিক প্রতিলিপিগুলি সরাসরি গ্রুপ বা চিকিত্সার মধ্যে qPCR ফলাফলের পরিসংখ্যানগত পার্থক্যকে মোকাবেলা করতে পারে।বিশেষ করে ডায়াগনস্টিক অ্যাসেসের জন্য, সাইট এবং অপারেটর জুড়ে সর্বোত্তম আন্তঃ-পরীক্ষণ নির্ভুলতা (পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা) রিপোর্ট করতে হবে।
6. সনাক্তকরণ দক্ষতা এবং LOD (মাল্টিপ্লেক্স qPCR-এ)
95% ইতিবাচক নমুনার মধ্যে LOD হল সর্বনিম্ন ঘনত্ব।অন্য কথায়, লক্ষ্য জিনের প্রতিলিপিগুলির একটি সেটের মধ্যে থাকা LOD এর ঘনত্ব ব্যর্থ প্রতিক্রিয়াগুলির 5% এর বেশি হওয়া উচিত নয়।মাল্টিপ্লেক্স কিউপিসিআর বিশ্লেষণ করার সময়, বিশেষত বিন্দু মিউটেশন বা পলিমরফিজমের যুগপত সনাক্তকরণের জন্য, মাল্টিপ্লেক্স কিউপিসিআরকে প্রমাণ সরবরাহ করতে হবে যে একই টিউবে একাধিক লক্ষ্য খণ্ডের নির্ভুলতা আপোস করা হয়নি, একাধিক সনাক্তকরণ এবং একক টিউব সনাক্তকরণ দক্ষতা এবং LOD একই হওয়া উচিত।বিশেষ করে যখন উচ্চ ঘনত্বের টার্গেট জিন এবং কম ঘনত্বের টার্গেট জিন একই সাথে প্রসারিত হয়, এই সমস্যাটির দিকে অবশ্যই মনোযোগ দিতে হবে।
সমস্যা এবং সমাধানসাধারণভাবে বলতে গেলে, প্রায়শই qPCR ডিবাগিংয়ে যেসব সমস্যা দেখা দেয় তা নিম্নোক্ত দিকগুলিতে ফোকাস করে:
· অনির্দিষ্ট পরিবর্ধন
প্রাইমারের ঘনত্বের কঠিন পছন্দ এবং প্রাইমার-ডাইমারের সাথে সমস্যা
· অ্যানিলিং তাপমাত্রা সঠিক নয়
· মাধ্যমিক গঠন পরিবর্ধন দক্ষতা প্রভাবিত করে
অনির্দিষ্ট পরিবর্ধন
অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনঘটে, এটি সাধারণত বিবেচনা করা হয় যে প্রাইমার ডিজাইন উপযুক্ত নয়, তবে আপনি যদি প্রাইমারগুলি পরিবর্তন করার তাড়াহুড়া না করেন তবে আপনি প্রথমে নিম্নলিখিত পদ্ধতিগুলি চেষ্টা করতে পারেন (নীতিটিও সংযুক্ত):
· অ্যানিলিং তাপমাত্রা বাড়ান - দুর্বল হাইড্রোজেন বন্ধন বজায় রাখতে অক্ষম করার চেষ্টা করুন;
· সংক্ষিপ্ত annealing এবং প্রসারিত সময় - দুর্বল হাইড্রোজেন বন্ড সম্ভাবনা কমাতে;
· প্রাইমারের ঘনত্ব হ্রাস করুন - অপ্রয়োজনীয় প্রাইমার এবং অ-টার্গেট অঞ্চলগুলির বাঁধনের সম্ভাবনা হ্রাস করুন;
কম পরিবর্ধন দক্ষতা
অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনের বিপরীত পরিস্থিতি - কম পরিবর্ধন দক্ষতা, এবং নিম্ন পরিবর্ধন দক্ষতার সাথে মোকাবিলা করার ব্যবস্থাগুলি ঠিক বিপরীত:
· annealing এবং প্রসারিত সময় দীর্ঘায়িত;
· তিন-পদক্ষেপ পিসিআর-এ পরিবর্তন করুন এবং অ্যানিলিং তাপমাত্রা হ্রাস করুন;
· প্রাইমার ঘনত্ব বৃদ্ধি;
Ps: 90-এর দশকে জন্মগ্রহণ করা অনেক স্নাতক শিক্ষার্থী কীভাবে পরীক্ষাগুলি ডিবাগ করতে হয় তা অধ্যয়ন করতে অনিচ্ছুক, এবং আশা করে যে কিটটি সম্পূর্ণভাবে সমস্যার সমাধান করতে পারে (যদি আপনি স্নাতক হওয়ার পরে গবেষণা এবং বিকাশের জন্য একটি রিএজেন্ট কোম্পানিতে যেতে চান), আসলে, রিএজেন্ট নির্মাতারাও এইভাবে চিন্তা করেন, আমি আশা করি এটি একটি বোকামি হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে যখন আপনি এটি পান, তাই প্রস্তুতকারকদের সমস্যা সমাধানের জন্য প্রচুর প্রচেষ্টা রয়েছে। দুর্বল এইচ-বন্ড শোষণের কারণগুলির প্রবর্তন।সমস্যাটি সহজে সমাধান করার জন্য, বোকাদের এখনও রিএজেন্ট কোম্পানির ভূমিকা পড়তে হবে যাতে দুর্বল হাইড্রোজেন বন্ড শোষণ করে এমন একটি ফ্যাক্টর আছে কিনা।
প্রাইমারের ঘনত্বের কঠিন পছন্দ এবং প্রাইমার-ডাইমারগুলির সাথে সমস্যা
পদ্ধতি 1: সাধারণভাবে বলতে গেলে, qPCR-এর জন্য কিট নির্দেশাবলীতে সুপারিশ করা হয়েছে সিস্টেম এবং প্রস্তাবিত প্রাইমার ঘনত্ব।
পদ্ধতি 2: প্রাইমার ঘনত্ব গ্রেডিয়েন্ট সেট করে ডিবাগিং।নিচের ছবিটি বোঝানোর জন্য একটি কোম্পানি থেকে চুরি করা হয়েছে।নীচের চিত্রটি তিনটি প্রাইমার ঘনত্ব গ্রেডিয়েন্ট (100nM, 250nM, 500nM) এবং চারটি টেমপ্লেট ঘনত্ব গ্রেডিয়েন্ট (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) দিয়ে তৈরি ফ্লুরোসেন্স পরিমাণগত ফলাফল দেখায়।পরীক্ষামূলক ফলাফলের Ct মান নিম্নরূপ প্লট করা হয়েছে:

প্রাইমার ঘনত্ব নির্বাচন প্রতিটি প্রাইমার ঘনত্বকে একটি লাইনে নিচের মত করে সংযুক্ত করুন:

প্রাইমার ঘনত্বের পছন্দটি সুস্পষ্ট, 100nM এবং 250nM এর প্রাইমার ঘনত্বের রৈখিক সম্পর্ক আরও ভাল, এবং 500nM এর প্রাইমার ঘনত্বের রৈখিক সম্পর্ক তুলনামূলকভাবে খারাপ।100nM এবং 250nM-এ, 250nM-এর Ct মান তুলনামূলকভাবে ছোট, তাই সর্বোত্তম প্রাইমার ঘনত্ব হল 250nM।সাধারণত গুরুতর প্রাইমার-ডাইমারগুলি গলে যাওয়া বক্ররেখায় দেখা যায়।যদি ডিজাইন করা প্রাইমার প্রাইমার-ডাইমার এড়াতে না পারে?
পদ্ধতি 3: প্রাইমারের পরিমাণ হ্রাস করুন এবং অ্যানিলিং তাপমাত্রা বাড়ান (ব্যাখ্যা করার দরকার নেই)।
অ্যানিলিং তাপমাত্রার পরীক্ষামূলক মান হল 60 ডিগ্রি সেলসিয়াস।আপনি যদি নিশ্চিত না হন তবে আরও উপযুক্ত অ্যানিলিং তাপমাত্রা কীভাবে নির্বাচন করবেন?উত্তরটি প্রাইমার ঘনত্বের পছন্দের মতোই -গ্রেডিয়েন্ট পরীক্ষা.সমস্যাটি বোঝাতে Bio-rad কোম্পানি থেকে একটি ছবি নিন।একটি নির্দিষ্ট লক্ষ্য খণ্ডের পরিবর্ধনের জন্য, আটটি তাপমাত্রা গ্রেডিয়েন্ট সেট করুন, প্রতিটিতে তিনটি পুনরাবৃত্তি সহ, এবং প্রাপ্ত পরিবর্ধন বক্ররেখাটি নিম্নরূপ:

অ্যানিলিং তাপমাত্রা নির্বাচন:
· 70°C, 69°C—মূলত, প্রাইমারগুলিকে একত্রিত করা যায় না, তাই কোনো পরিবর্ধন নেই।
·67.3°C - শুরুতে অল্প পরিমাণে পরিবর্ধন রয়েছে এবং Ct মান তুলনামূলকভাবে বড়।
· 64.5°C——Ct মান হ্রাস পায়।
· 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, এবং 55.0°C, Ct মানগুলি মূলত স্থিতিশীল ছিল, কিন্তু চূড়ান্ত প্রতিপ্রভ মানগুলি ভিন্ন ছিল।
কিভাবে নির্বাচন করবেন?নীতি: প্রথম নীতি হল উচ্চ Ct মান।একই Ct মানের জন্য, dimerization এবং অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন এড়াতে একটি উচ্চ অ্যানিলিং তাপমাত্রা বেছে নিন।যদিও 55 ডিগ্রি সেলসিয়াসে উচ্চতর ফ্লুরোসেন্স মান রয়েছে, তবে এতে ডাইমার বা অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন থাকতে পারে।
কিন্তু আপনি যদি আপনার মতো স্মার্ট হন, আপনি অবশ্যই ভাববেন: যৌক্তিকভাবে বলতে গেলে, পিসিআর প্রতিক্রিয়া যদি খুব নির্দিষ্ট হয়, যতক্ষণ না প্রাইমারের ঘনত্ব ন্যূনতম প্রয়োজনীয়তা অতিক্রম করে, ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জক এবং dNTP-এর মতো উচ্চ এবং নিম্ন পয়েন্টগুলির কোনও প্রভাব থাকা উচিত নয়।প্রকৃতপক্ষে, যতক্ষণ পর্যন্ত অ্যানিলিং তাপমাত্রা সঠিকভাবে অপ্টিমাইজ করা হয়, ততক্ষণ Ct মানের উপর প্রাইমার ঘনত্বের প্রভাব স্বাভাবিকভাবেই ন্যূনতম হবে।

অ্যানিলিং তাপমাত্রা সঠিকভাবে অপ্টিমাইজ করা হয়েছে এবং সিটিতে প্রাইমার ঘনত্বের প্রভাব কমিয়ে আনা হবে
মাধ্যমিক গঠন পরিবর্ধন দক্ষতা প্রভাবিত করে
সমস্যাটি বোঝাতে Bio-rad থেকে ছবিটি নেওয়া যাক।এটি একটি মাধ্যমিক কাঠামোর সাথে একটি জিনকে প্রশস্ত করার জন্য একটি তাপমাত্রা গ্রেডিয়েন্টও ডিজাইন করে।

গৌণ কাঠামো আবির্ভূত হয়
এটা দেখা যায় যে তাপমাত্রার গ্রেডিয়েন্ট কমে যাওয়ার সাথে সাথে পণ্যগুলি উপস্থিত হতে শুরু করে এবং Ct মান এগিয়ে যায়, সর্বনিম্ন মান 60.7°C এ পৌঁছায় এবং তারপর তাপমাত্রার গ্রেডিয়েন্ট কমে যাওয়ার সাথে সাথে Ct মান আরও বড় হয়।বিপরীতভাবে, তাপমাত্রা বৃদ্ধির সাথে সাথে গৌণ কাঠামো খুলে যায় এবং পরিবর্ধন দক্ষতা বৃদ্ধি পায়।একটি নির্দিষ্ট তাপমাত্রায় পৌঁছানোর পরে, তাপমাত্রা বৃদ্ধি প্রশস্তকরণ দক্ষতা উন্নত করতে পারে না।কারণ এই সময়ে প্রাইমারগুলি স্থিরভাবে একত্রিত করা যায় না।অতএব,সর্বনিম্ন Ct মান সহ তাপমাত্রা দেখুন, যা সেকেন্ডারি স্ট্রাকচার টেমপ্লেটকে প্রশস্ত করার জন্য সর্বোত্তম তাপমাত্রা!অবশ্যই, স্মার্ট বোকাদের অবশ্যই জানা উচিত যে যদি এটি প্রয়োজনীয় না হয় তবে প্রাইমারগুলি পরিবর্তন করা এবং গৌণ কাঠামোর অঞ্চলটি এড়ানো ভাল।
5. আবেদনের স্তর
MIQE - ডেটা বিশ্লেষণ

ডেটা বিশ্লেষণ প্রধানত ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর যন্ত্র দ্বারা দেওয়া হয়।পূর্ববর্তী নিবন্ধে, প্রচুর ডেটা বিশ্লেষণের কাজ করা হয়েছে, যেমন ফাঁকা নিয়ন্ত্রণ, যা পরীক্ষার ডিজাইনে ব্যাখ্যা করা হয়েছে।অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিন, পুনরাবৃত্তি সংখ্যা ইত্যাদি স্পষ্ট করা হয়েছে।, এখানে আমরা মূলত qPCR এর প্রয়োগ ব্যাখ্যা করি।
qPCR ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়, এবং পরীক্ষামূলক যাচাইকরণ এবং নিউক্লিক অ্যাসিড নির্ণয় হল সর্বাধিক ব্যবহৃত পরিস্থিতি।
পরম পরিমাণ নির্ধারণ
লগ (প্রাথমিক ঘনত্ব) চক্রের সংখ্যার সাথে একটি রৈখিক সম্পর্ক রয়েছে।পরিচিত প্রারম্ভিক কপি নম্বর সহ একটি আদর্শ থেকে একটি আদর্শ বক্ররেখা আঁকা যেতে পারে, অর্থাৎ, পরিবর্ধন বিক্রিয়ার রৈখিক সম্পর্ক প্রাপ্ত করা যেতে পারে।নমুনার Ct মান অনুসারে, নমুনার ঘনত্ব গণনা করা যেতে পারে।টেমপ্লেটের পরিমাণ অন্তর্ভুক্ত করতে হবে।

পরম পরিমাণগত গণনা পদ্ধতি
পরম পরিমাপ মান বক্ররেখা উপর ভিত্তি করে করা আবশ্যক.একটি আদর্শ বক্ররেখা তৈরি করতে, একটি মান প্রয়োজন।সাধারণত, স্ট্যান্ডার্ড হল একটি প্লাজমিড যা লক্ষ্য জিনের ক্লোনিং করে প্রাপ্ত হয়।কেন এটি একটি প্লাজমিড?কারণ বৃত্তাকার প্লাজমিড ডিএনএ সবচেয়ে স্থিতিশীল।দ্বিগুণ অনুপাত (10-গুণ তরলীকরণ) অনুযায়ী মানক পণ্যটিকে 5 থেকে 6 গ্রেডিয়েন্টে পাতলা করুন এবং পাতলা করার সময় অভিন্নতার দিকে মনোযোগ দিন।Ct মান 15-30 এর মধ্যে পড়ে যাক।

স্ট্যান্ডার্ড প্রস্তুতি
একই সময়ে, পরীক্ষা করা নমুনাটিও সেই অনুযায়ী পাতলা করা উচিত (ডিলিউশন ফ্যাক্টরটি মনে রাখবেন), এবং Ct মানটিও 15-30 এর মধ্যে হওয়া উচিত।স্ট্যান্ডার্ড পণ্য + পরীক্ষা করা নমুনা একসঙ্গে মেশিনে রাখা হয়.রান করার পরে, স্ট্যান্ডার্ড পদার্থ দিয়ে একটি স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখা তৈরি করা হয়েছিল এবং যে নমুনাগুলি পরীক্ষা করা হবে তা ঘনত্ব গণনা করার জন্য স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখায় আনা হয়েছিল।
হেপাটাইটিস বি ভাইরাস এইচবিভি পরিমাপ একটি সাধারণ পরম পরিমাপ, যা 1 মিলি রক্তে ভাইরাসের অনুলিপি সংখ্যা গণনা করতে পারে।
কপি নম্বর গণনা
নমুনা ঘনত্ব পরীক্ষা করা হবে (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × dilution factor
নমুনা আণবিক ওজন = ঘাঁটির সংখ্যা × 324
নমুনার কপি নম্বর পরীক্ষা করা হবে (কপি/উল) = পরীক্ষা করা নমুনার ঘনত্ব / নমুনার আণবিক ওজন × 6 × 1014

কপি নম্বর গণনা পদ্ধতি

উপরোক্তটি পরিমাণ নির্ধারণের জন্য গণনা পদ্ধতি।এটি একটি গাণিতিক সমস্যা যা জুনিয়র হাই স্কুল থেকে স্নাতক হওয়ার পরে সমাধান করা যেতে পারে এবং গাণিতিক সমস্যাগুলি সাধারণত কম্পিউটার দ্বারা সমাধান করা হয়।আপনি যদি বুঝতে না পারেন, আপনি যোগাযোগ করতে আসতে পারেন.
আপেক্ষিক পরিমাপ
আপেক্ষিক পরিমাণ নির্ধারণ প্রধানত বৈজ্ঞানিক গবেষণায় ব্যবহৃত হয়।1ml রক্তে কতগুলি ভাইরাস আছে এবং এটি একটি ডিএনএ ভাইরাস, এটি একটি তুলনামূলকভাবে নির্ধারক ঘটনা: রক্তের পরিমাণ নির্ধারণ করা যেতে পারে এবং ডিএনএ ভাইরাস তুলনামূলকভাবে স্থিতিশীল।যাইহোক, একটি পাতায় একটি নির্দিষ্ট জিনের ট্রান্সক্রিপশন কপির সংখ্যা তুলনা করা আমাদের পক্ষে কঠিন, কারণ পাতার আকার, ওজন এবং কোমলতা নির্ণয় করা কঠিন, নিষ্কাশিত RNA-এর পরিমাণ নির্ণয় করা কঠিন, এবং বিপরীত প্রতিলিপির কার্যকারিতাও নির্ণয় করা কঠিন, অর্থাৎ, কোনো পদক্ষেপের ফলে পরীক্ষামূলক ডেটা ব্যবহার করা যাবে না।
অতএব, আপেক্ষিক পরিমাপ অবশ্যই একটি উপাদান প্রবর্তন করবে:অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিন।
অন্য কথায়, আপেক্ষিক পরিমাপ আসলে লক্ষ্য জিন এবং অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিনের মধ্যে একটি তুলনা।একই টিস্যু এবং একই কোষের তুলনায়, নমুনার আকারের প্রভাব, আরএনএ নিষ্কাশনের পরিমাণ, বিপরীত প্রতিলিপি দক্ষতা এবং পিসিআর দক্ষতা তুলনামূলকভাবে ছোট।ছোট নমুনার আকারের কারণে, অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিন এবং লক্ষ্য জিন উভয়ই তুলনামূলকভাবে হ্রাস পেয়েছে।এ কারণে আমরা আগেও অভিন্নতা ও স্থিতিশীলতার ওপর জোর দিয়ে আসছি।
অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিন সাধারণত হয়গৃহস্থালির জিন(হাউস-কিপিং জিন), যা এক শ্রেণীর জিনকে নির্দেশ করে যা সমস্ত কোষে স্থিরভাবে প্রকাশ করা হয় এবং কোষের মৌলিক জীবন ক্রিয়াকলাপ বজায় রাখার জন্য তাদের পণ্যগুলি প্রয়োজনীয়।
এই ধারণা বিভ্রান্ত করবেন না.হাউসকিপিং জিন হল জৈবিক ফাংশন পদ, যখন অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিন হল পরীক্ষামূলক প্রযুক্তিগত পদ।হাউসকিপিং জিনগুলিকে অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিন হিসাবে নির্বাচন করার আগে বৈধতা পাস করতে হবে।
উদাহরণস্বরূপ, আমরা বিভিন্ন টিস্যু কোষে তাদের প্রকাশের মাত্রা পরীক্ষা করার জন্য নীচের চিত্রে বেশ কয়েকটি হাউসকিপিং জিন নির্বাচন করেছি এবং দেখেছি যে β-2-মাইক্রোগ্লোবুলিনের অভিব্যক্তি স্তরগুলি অন্য তিনটি জিনের থেকে বেশ আলাদা, তাই সেগুলি অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিন হিসাবে ব্যবহার করা যায়নি।

অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিনের সংশোধন ফাংশন বোঝার পরে, অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিনের প্রবর্তনের কারণে দুটি অ্যালগরিদম পাওয়া যায়।
· ডাবল স্ট্যান্ডার্ড কার্ভ পদ্ধতি
·2 – △△Ct পদ্ধতি (CT মান তুলনা পদ্ধতি)
আপনি যদি প্রজাতি এবং জিন ফাংশন অধ্যয়ন করতে আগ্রহী হন, অনুগ্রহ করে অ্যালগরিদম নিয়ে গবেষণা ছেড়ে দিন এবং সরাসরি সূত্র ব্যবহার করুন, অথবা সরাসরি মেশিন ব্যবহার করুন;আপনি যদি গণিত এবং প্রকৌশলে একজন সোজা লোক হন তবে অনুগ্রহ করে নির্দ্বিধায়।
ডবল স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখা পদ্ধতি
নিয়ন্ত্রণ নমুনার টার্গেট জিন এবং হাউসকিপিং জিন এবং স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখার মাধ্যমে পরীক্ষা করা নমুনা পরিমাপ করুন এবং তারপর গণনার সূত্র অনুসারে আপেক্ষিক মান গণনা করুন, যা আপেক্ষিক অভিব্যক্তি স্তর।
সুবিধা: সহজ বিশ্লেষণ, তুলনামূলকভাবে সহজ পরীক্ষামূলক অপ্টিমাইজেশান
অসুবিধা: প্রতিটি জিনের জন্য, পরীক্ষার প্রতিটি রাউন্ড অবশ্যই একটি আদর্শ বক্ররেখা তৈরি করবে
প্রয়োগ: জিন এক্সপ্রেশন নিয়ন্ত্রণ অধ্যয়নে দুটি সর্বাধিক ব্যবহৃত এবং স্বীকৃত আপেক্ষিক পরিমাণগত পদ্ধতির মধ্যে একটি
সূত্রটি নিম্নরূপ:

উদাহরণ নিম্নরূপ:

পরিমাণগত ফলাফলের উপর ভিত্তি করে আপেক্ষিক পরিমাণ গণনা করুন
2 – △△Ct পদ্ধতি (CT মান তুলনা পদ্ধতি)

সুবিধা: একটি আদর্শ বক্ররেখা করতে হবে না
অসুবিধা: এটা অনুমান করা হয় যে পরিবর্ধন দক্ষতা 100% এর কাছাকাছি;মানক বিচ্যুতি হল <5%, এবং মান বক্ররেখা এবং প্রতিটি পরিবর্ধনের মধ্যে দক্ষতা সামঞ্জস্যপূর্ণ বলে ধরে নেওয়া হয়;পরীক্ষামূলক অবস্থার অপ্টিমাইজেশন আরও জটিল।
প্রয়োগ: জিন এক্সপ্রেশন নিয়ন্ত্রণ অধ্যয়নে দুটি সর্বাধিক ব্যবহৃত এবং স্বীকৃত আপেক্ষিক পরিমাণগত পদ্ধতির মধ্যে একটি

অবশ্যই, পরিবর্ধন কার্যকারিতা সাধারণত সম্পূর্ণরূপে অসম্ভব 1। সংশোধন পদ্ধতি: যদি আমরা জানি যে লক্ষ্য জিন এবং রেফারেন্স জিনের পরিবর্ধন দক্ষতা একই, কিন্তু পরিবর্ধন দক্ষতা 1 এর সমান নয়, তাহলে 2－△△Ct সংশোধন করা যেতে পারে: 0.95 হয়, তাহলে গণনার সূত্রটি 1.95－△△Ct এ সংশোধন করা যেতে পারে
এখন পর্যন্ত, ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর সম্পর্কিত বিষয়বস্তু শেষ হয়ে গেছে।