আমরা অভিজ্ঞ প্রস্তুতকারক হয়েছে.বিগ ডিসকাউন্টিং চায়না হাই সেনসিটিভিটি ওয়ান-স্টেপ প্রোব Rt-এর জন্য এর বাজারের গুরুত্বপূর্ণ সার্টিফিকেশনে সংখ্যাগরিষ্ঠতা অর্জন করাQpcrকিট V2, গুণমান হল কারখানার জীবন, গ্রাহকের চাহিদার উপর ফোকাস হল কোম্পানির টিকে থাকা এবং উন্নয়নের উৎস, আমরা সততা এবং ভাল বিশ্বাসের কাজের মনোভাব মেনে চলি, আপনার আসার অপেক্ষায়!
আমরা অভিজ্ঞ প্রস্তুতকারক হয়েছে.জন্য এর বাজারের গুরুত্বপূর্ণ সার্টিফিকেশন সংখ্যাগরিষ্ঠ জয়চায়না তাক ডিএনএ পলিমারেজ, Qpcr, আমাদের কোম্পানি প্রতিশ্রুতি: যুক্তিসঙ্গত মূল্য, স্বল্প উৎপাদন সময় এবং সন্তোষজনক বিক্রয়োত্তর সেবা, আমরা আপনাকে যে কোনো সময় আমাদের কারখানা পরিদর্শন করতে স্বাগত জানাই।আশা করি এখন আমরা একসাথে একটি মনোরম এবং দীর্ঘমেয়াদী ব্যবসা করি!!!

বর্ণনা

এই কিটটি একটি অনন্য লাইসিস বাফার সিস্টেম ব্যবহার করে যা দ্রুত RT-qPCR প্রতিক্রিয়ার জন্য সংষ্কৃত কোষের নমুনা থেকে RNA মুক্ত করতে পারে, যার ফলে সময়সাপেক্ষ এবং শ্রমসাধ্য আরএনএ পরিশোধন প্রক্রিয়াটি দূর হয়।আরএনএ টেমপ্লেট মাত্র 7 মিনিটের মধ্যে পাওয়া যাবে।কিট দ্বারা প্রদত্ত 5×ডাইরেক্ট RT মিক্স এবং 2×ডাইরেক্ট qPCR মিক্স-SYBR রিএজেন্টগুলি দ্রুত এবং কার্যকরভাবে রিয়েল-টাইম পরিমাণগত PCR ফলাফল পেতে পারে।

5×Direct RT Mix এবং 2×Direct qPCR মিক্স-SYBR-এর শক্তিশালী ইনহিবিটর সহনশীলতা রয়েছে এবং নমুনার লাইসেট সরাসরি RT-qPCR-এর টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে।এই কিটটিতে রয়েছে অনন্য আরএনএ হাই-অ্যাফিনিটি ফোরজিন রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ, এবং হট ডি-টাক ডিএনএ পলিমারেজ, ডিএনটিপি, এমজিসিএল₂, প্রতিক্রিয়া বাফার, পিসিআর অপ্টিমাইজার এবং স্টেবিলাইজার।

স্পেসিফিকেশন

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

কিট উপাদান

বৈশিষ্ট্য ও সুবিধা

■ সহজ এবং কার্যকর: সেল ডাইরেক্ট আরটি প্রযুক্তির সাহায্যে, মাত্র 7 মিনিটের মধ্যে RNA নমুনা পাওয়া যায়।

■ নমুনার চাহিদা ছোট, যত কম 10টি কোষ পরীক্ষা করা যেতে পারে।

■ উচ্চ থ্রুপুট: এটি দ্রুত 384, 96, 24, 12, 6-ওয়েল প্লেটে সংষ্কৃত কোষে RNA সনাক্ত করতে পারে।

■ ডিএনএ ইরেজার দ্রুত প্রকাশিত জিনোম অপসারণ করতে পারে, পরবর্তী পরীক্ষামূলক ফলাফলের উপর প্রভাব অনেক কমিয়ে দিতে পারে।

■ অপ্টিমাইজ করা RT এবং qPCR সিস্টেম দ্বি-পদক্ষেপ RT-PCR বিপরীত প্রতিলিপিকে আরও দক্ষ করে তোলে এবং পিসিআরকে আরও সুনির্দিষ্ট করে, এবং RT-qPCR প্রতিক্রিয়া প্রতিরোধকগুলির প্রতি আরও প্রতিরোধী করে তোলে।

কিট অ্যাপ্লিকেশন

প্রয়োগের সুযোগ: সংষ্কৃত কোষ।

- নমুনা লাইসিস দ্বারা প্রকাশিত RNA: শুধুমাত্র এই কিটের RT-qPCR টেমপ্লেটের জন্য প্রযোজ্য।

- কিটটি নিম্নলিখিত উদ্দেশ্যে ব্যবহার করা যেতে পারে: জিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ, siRNA-মধ্যস্থিত জিন সাইলেন্সিং প্রভাবের যাচাইকরণ, ড্রাগ স্ক্রীনিং ইত্যাদি।

ডায়াগ্রাম

স্টোরেজ এবং শেলফ লাইফ

এই কিটের অংশ I 4℃ এ সংরক্ষণ করা উচিত;পার্ট II -20℃ এ সংরক্ষণ করা উচিত।

ফোরজিন প্রোটিজ প্লাস II 4 ℃ এ সংরক্ষণ করা উচিত, -20 ℃ এ হিমায়িত করবেন না।

বিকারক 2×ডাইরেক্ট qPCR মিক্স-SYBR অন্ধকারে -20℃ এ সংরক্ষণ করা উচিত;যদি ঘন ঘন ব্যবহার করা হয়, তবে এটি স্বল্পমেয়াদী স্টোরেজের জন্য 4℃ এ সংরক্ষণ করা যেতে পারে (10 দিনের মধ্যে ব্যবহার করুন)। আমরা অভিজ্ঞ প্রস্তুতকারক।বিগ ডিসকাউন্টিং চায়না হাই সেনসিটিভিটি ওয়ান-স্টেপ প্রোব Rt-Qpcr কিট V2 এর জন্য এর বাজারের গুরুত্বপূর্ণ সার্টিফিকেশনে সংখ্যাগরিষ্ঠতা জয় করে, গুণমান হল কারখানার জীবন, গ্রাহকের চাহিদার উপর ফোকাস হল কোম্পানির বেঁচে থাকা এবং উন্নয়নের উত্স, আমরা সততা এবং ভাল বিশ্বাসের কাজের মনোভাব মেনে চলি, আপনার আসার অপেক্ষায়!
বড় ডিসকাউন্টিংচায়না তাক ডিএনএ পলিমারেজ, Qpcr, আমাদের কোম্পানি প্রতিশ্রুতি দেয়: যুক্তিসঙ্গত মূল্য, স্বল্প উৎপাদন সময় এবং সন্তোষজনক বিক্রয়োত্তর সেবা, আমরা আপনাকে যে কোনো সময়ে আমাদের কারখানা পরিদর্শন করতে স্বাগত জানাই।আশা করি এখন আমরা একসাথে একটি মনোরম এবং দীর্ঘমেয়াদী ব্যবসা করি!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qপিসিআর Kit -তাকমan

Cat.No.DRT-01021/01022

সেলের জন্য সরাসরি RT-qPCR ≤ 1000,000 সেল ব্যবহার করে

পণ্য পরিচিতি

এই পণ্যটি RT-qPCR প্রতিক্রিয়ার জন্য সংষ্কৃত কোষের নমুনাগুলি থেকে দ্রুত RNA মুক্ত করার জন্য একটি অনন্য লাইসিস বাফার সিস্টেম ব্যবহার করে, সময়সাপেক্ষ এবং শ্রমসাধ্য RNA পরিশোধন প্রক্রিয়া দূর করে, এবং প্রয়োজনীয় RNA টেমপ্লেট পেতে মাত্র 7 মিনিট, 5× ডাইরেক্ট RT মিক্স, 2× ডাইরেক্ট qPCR মিক্স-Taquiman এর দ্বারা দ্রুত সরবরাহ করা সম্ভব। ফলাফল

5× ডাইরেক্ট আরটি মিক্স এবং 2 × ডাইরেক্ট qPCR মিক্স-টাকম্যানের শক্তিশালী ইনহিবিটর সহনশীলতা রয়েছে এবং একটি টেমপ্লেট হিসাবে পরিমাপ করার জন্য নমুনার লাইসেট ব্যবহার করে দক্ষ বিপরীত এবং নির্দিষ্ট পরিবর্ধন করতে পারে।বিকারকটিতে রয়েছে ফোরজিন রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ, হট ডি-টাক ডিএনএ পলিমারেজ, ডিএনটিপি, এমজিসিএল₂, প্রতিক্রিয়া বাফার, পিসিআর অপ্টিমাইজার এবং স্টেবিলাইজার, যা দ্রুত এবং সহজে নমুনা সনাক্ত করতে লাইসিস বাফারের সাথে ব্যবহার করা যেতে পারে এবং উচ্চ সংবেদনশীলতা, নির্দিষ্টতা এবং স্থিতিশীলতার বৈশিষ্ট্য রয়েছে।

পণ্যের বৈশিষ্ট্য

সহজ, কার্যকর সেল ডাইরেক্ট আরটি প্রযুক্তি যা RNA নমুনা পেতে 7 মিনিটের মতো সময় নেয়।

নমুনার প্রয়োজনীয়তা ছোট, এবং পরীক্ষার জন্য ন্যূনতম 10টি সংষ্কৃত কোষ ব্যবহার করা যেতে পারে।

384, 96, 24, 12 এবং 6-ওয়েল প্লেটের মতো কালচারড সেলগুলির দ্রুত RNA অধিগ্রহণের জন্য উচ্চ থ্রুপুট।

ডিএনএ ইরেজার দ্রুত প্রকাশিত জিনোমগুলিকে অপসারণ করতে সক্ষম হয়, যা পরবর্তী পরীক্ষামূলক ফলাফলের উপর প্রভাবকে ব্যাপকভাবে হ্রাস করে।

অপ্টিমাইজ করা RT এবং qPCR সিস্টেমগুলি আরও দক্ষ রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন, নির্দিষ্টতা এবং শক্তিশালী RT-qPCR প্রতিক্রিয়া ইনহিবিটর সহনশীলতার সাথে দ্বি-পদক্ষেপ RT-PCR সক্ষম করে।

কিট অ্যাপ্লিকেশন

প্রয়োগের সুযোগ: সভ্য কোষ।

নমুনা লাইসিস ব্যাখ্যা করা RNA: শুধুমাত্র একটি দ্বি-পদক্ষেপ RT-qPCR টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহৃত হয়।

কিটগুলি নিম্নলিখিত উদ্দেশ্যে ব্যবহার করা যেতে পারে: জিন নিয়ন্ত্রক অভিব্যক্তি বিশ্লেষণ, অ্যালিল পরীক্ষা, ড্রাগ স্ক্রীনিং ইত্যাদি।

কিট সীমাবদ্ধতা

পরিবর্ধিত টুকরা ≤ 300 bp.

কিটগুলি তাজাভাবে কোষগুলিকে সংস্কৃতিতে ব্যবহার করা হয়।

পণ্যের মান নিয়ন্ত্রণ

FOREGENE-এর টোটাল কোয়ালিটি ম্যানেজমেন্ট সিস্টেম অনুসারে, সেল ডাইরেক্ট RT-qPCR সিরিজের কিটগুলির প্রতিটি ব্যাচের কিটগুলির প্রতিটি ব্যাচের মানের নির্ভরযোগ্যতা এবং স্থিতিশীলতা নিশ্চিত করতে একাধিকবার কঠোরভাবে পরীক্ষা করা হয়।

কিট বিষয়বস্তু

*:সেল লাইসিস, 5×ডাইরেক্ট আরটি মিক্স, 2× ডাইরেক্ট qPCR মিক্স-টাকমান আলাদাভাবে কেনা যায়, বিস্তারিত পরিশিষ্ট 1 (পৃষ্ঠা 13) এ দেওয়া আছে।

জমা শর্ত

1. শিপিং শর্তাবলী

কম তাপমাত্রার আইস প্যাক বক্স পরিবহনের পুরো প্রক্রিয়া, নিশ্চিত করতে যে কিটটি <4 °C অবস্থায় আছে।

2. স্টোরেজ শর্ত

পার্ট I 4°C এবং পার্ট II -20°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করুন।

Foregene Protease Plus II 4°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা উচিত, -20°C এ হিমায়িত নয়।

রিএজেন্ট 2× ডাইরেক্ট qPCR মিক্স-টাকম্যান -20°C, অথবা 4°C-এ স্বল্পমেয়াদী ব্যবহারের জন্য সংরক্ষণ করা হয় যদি ঘন ঘন ব্যবহার করা হয় (10 দিনের মধ্যে)।

কিট উপাদান তথ্য

বাফার সিএল: সেল লাইসিস প্রতিক্রিয়ার জন্য প্রয়োজনীয় পরিবেশ সরবরাহ করে।

বাফার এসটি: পরবর্তী আরটি-তে প্রভাব এড়াতে লাইসেটে সক্রিয় পদার্থকে শেষ করে দেয়।

ডিএনএ ইরেজার: ডিএনএ রিমুভার, পরবর্তী পরীক্ষায় জিনোম অপসারণের প্রভাব।

5× ডাইরেক্ট আরটি মিক্স: উচ্চ RNA অ্যাফিনিটি ফোরজিন রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ, RNase ইনহিবিটর, dNTPs, স্টেবিলাইজার, বর্ধক, অপ্টিমাইজার এবং সর্বোত্তম প্রান্তিককরণের জন্য রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন প্রাইমার রয়েছে (র্যান্ডম প্রাইমার, অলিগো(ডিটি)₁₈প্রাইমার)।

ফোরজিন প্রোটিজ প্লাস II: লাইসিস বাফারের পরিপ্রেক্ষিতে, কোষগুলিকে নিউক্লিক অ্যাসিড মুক্ত করার জন্য লাইজ করা হয়।

2× ডাইরেক্ট qPCR মিক্স-টাকম্যান: এই রিএজেন্টে রয়েছে হট ডি-টাক ডিএনএ পলিমারেজ, ডিএনটিপি, এমজিসিএল₂, প্রতিক্রিয়া বাফার, PCR অপ্টিমাইজার, এবং স্টেবিলাইজার।

20× ROX রেফারেন্স ডাই: সাধারণত ABI, Stratagene এবং অন্যান্য কোম্পানির রিয়েল টাইম পিসিআর পরিবর্ধন যন্ত্রে ব্যবহৃত হয়, এটি পিসিআর ডোজিং ত্রুটির কারণে পিসিআর টিউব এবং টিউবের মধ্যে পার্থক্য সামঞ্জস্য করতে ব্যবহৃত হয়।বিভিন্ন যন্ত্রের জন্য প্রয়োজনীয় 20× ROX রেফারেন্স ডাই ঘনত্ব ভিন্ন, এবং ব্যবহারকারী যন্ত্রের প্রস্তাবিত ঘনত্ব অনুযায়ী এটি যোগ করতে পারেন।

RNase-মুক্ত ddH₂O: RNase-মুক্ত জীবাণুমুক্ত অতি বিশুদ্ধ জল দ্বি-পদক্ষেপ RT-qPCR প্রতিক্রিয়ার জন্য।

সতর্কতা:(কিট ব্যবহার করার আগে সাবধানে সতর্কতা পড়তে ভুলবেন না)

নমুনার মধ্যে ক্রস-দূষণ এড়াতে পরীক্ষার অপারেশন পদ্ধতিতে মনোযোগ দিন।

RNase দূষণ এবং RNA অবক্ষয় এড়াতে পরীক্ষামূলক পরিবেশ এবং পাত্রের পরিচ্ছন্নতার দিকে মনোযোগ দিন।

তাজা বা ভালভাবে সংরক্ষিত কোষের নমুনা নিন এবং বারবার ফ্রিজ-গলানো কোষের নমুনা ব্যবহার করবেন না।

5× ডাইরেক্ট qPCR মিক্স, 2× ডাইরেক্ট qPCR মিক্স-টাকম্যান বারবার ফ্রিজ-থাও এড়াতে হবে, অন্যথায় এটি বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন এবং পিসিআর দক্ষতাকে প্রভাবিত করবে।

প্রিপারেশনআগেঅপারেশন

এই কিট ব্যবহার করার আগে সাবধানে নির্দেশাবলী পড়তে ভুলবেন না.সেল ডাইরেক্ট RT-qPCR কিটটি সহজ, সুবিধাজনক এবং দ্রুত কাজ করে এবং নির্দেশাবলী সম্পূর্ণ কিট সম্পর্কে সম্পূর্ণ তথ্য প্রদান করে এবং কীভাবে এটি সঠিকভাবে ব্যবহার করতে হয়।অনুগ্রহ করে ব্যবহারের আগে প্রয়োজনীয় পরীক্ষামূলক উপকরণ এবং সরঞ্জাম প্রস্তুত করুন।

পরীক্ষামূলক উপকরণ এবং সরঞ্জাম

◆ সংস্কৃতি কোষ।

◆ 1.5 মিলি বা 2 মিলি, RNase-/DNase-মুক্ত সেন্ট্রিফিউজ টিউব, RNase-/DNase-মুক্ত টিপ, 0.2 মিলি জীবাণুমুক্ত qPCR টিউব।

◆ qPCR মেশিন, পাইপেট, ট্যাবলেটপ সেন্ট্রিফিউজ (≥13,400×g) (পরীক্ষামূলক প্রয়োজনের উপর নির্ভর করে), ইত্যাদি

নিরাপত্তা

◆ এই পণ্যটি শুধুমাত্র বৈজ্ঞানিক গবেষণার উদ্দেশ্যে, দয়া করে এটি ফার্মাসিউটিক্যাল, ক্লিনিকাল, খাদ্য এবং প্রসাধনী উদ্দেশ্যে ব্যবহার করবেন না।

◆ রাসায়নিক ব্যবহার করার সময়, উপযুক্ত ল্যাবের পোশাক, গ্লাভস, প্রতিরক্ষামূলক চশমা ইত্যাদি পরুন।

অপারেশনগাইড

পরিশিষ্ট 1 (পৃষ্ঠা 13) এ বিস্তারিত জানার জন্য সেল লাইসিস সিস্টেম, RT সিস্টেম এবং qPCR প্রতিক্রিয়া সমাধান সম্পূরক প্যাকগুলি আলাদাভাবে কেনা যেতে পারে।

অপারেশন গাইড

উত্তর: নমুনা আরএনএ প্রকাশ

1. কোষগুলিকে প্রিট্রিটেড করা হয়েছিল: ঠাণ্ডা পিবিএস দিয়ে সেল কালচার প্লেটটি ধুয়ে ফেলুন, তারপর কোষগুলিকে লাইস করুন (10-10⁶), 10⁶ কোষের পরিমাণের চেয়ে, RNA নিষ্কাশন এবং পরিশোধনের জন্য ফোরজিন দ্য সেল একটি RNA আইসোলেশন কিট দ্য টোটাল (DE-03111) বা অ্যানিমাল টোটাল RNA আইসোলেশন কিট (DE-03011) সুপারিশ করা হয়।

1.1।অনুগত কোষ (উদাহরণস্বরূপ 24- ভাল প্লেট)

1.1.1।প্রতিটি কূপের কোষের সংখ্যা নির্ধারণ করুন, কোষের সংখ্যা 1 × 10 হবে তা নির্ধারণ করুন⁵, এবং সংস্কৃতির থালা থেকে সংস্কৃতি মাধ্যম অপসারণ করতে একটি পাইপেট ব্যবহার করুন।

1.1.2।প্রতিটি কূপে 200 μl প্রি-চিল্ড 1 × PBS যোগ করুন।বারবার পাইপেট করবেন না এবং কূপ থেকে পিবিএস সরান।প্লেটটি কাত করুন এবং যতটা সম্ভব পিবিএস সরান।ধাপ 2 এ এগিয়ে যান।

1.1.3।সেল কালচার ডিশে বিভিন্ন সেল কালচার ডিশ বা রেফারেন্স নম্বর টেবিল 1-1 কোষ ধোয়ার জন্য প্রিকুলড 1 × PBS যোগ করা হয়েছিল।

টেবিল 1-1: বিভিন্ন সংখ্যক কোষের জন্য পিবিএস ডোজ

বিঃদ্রঃ：একটি দৃঢ় অনুগত কোষ নিশ্চিত করতে,ধোয়ার সময় প্রচুর পরিমাণে কোষের ক্ষতি এড়ানো যায়।

1.2।সাসপেনশন সেল বা অনুগত কোষগুলি অ ছিদ্রযুক্ত প্লেটে সংষ্কৃত হয়

1.2.1।নন-মাল্টি ওয়েল প্লেটে সংষ্কৃত অনুগত কোষ (সাসপেনশন সেল পরবর্তী ধাপ 1.2.2 থেকে শুরু হয়), সাধারণ কোষ সংগ্রহ পদ্ধতি অনুসারে কোষগুলি সংগ্রহ করে আলাদা করুন এবং একটি কালচার প্লেট বা সেন্ট্রিফিউজ টিউবে রাখুন;যদি ট্রিপসিনাইজেশন ব্যবহার করা হয়, কোষগুলি সংগ্রহ করতে এবং অবশিষ্ট ট্রিপসিন অপসারণের জন্য সেন্ট্রিফিউগেশনের প্রয়োজন হয়, কোষগুলিকে ছড়িয়ে দেওয়ার জন্য পৃথক কোষে পিবিএস পুনরুদ্ধার করা কোষ যুক্ত করা হয়।

1.2.2।কক্ষের সংখ্যা গণনা করার পর, 1x10 aliquoted কোষ⁵ এক থেকে সেন্ট্রিফিউজ টিউব, 10 মিনিটের জন্য 1000 × g সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে কোষ সংগ্রহ করুন।

1.2.3।সেন্ট্রিফিউজ টিউবে 200 μl পিবিএস যোগ করুন, বারবার পাইপেট করবেন না এবং সরাসরি পিবিএস অ্যাসপিরেট করুন।ধাপ 2-এ এগিয়ে যান। (যদি বর্ষণ করা কঠিন হয় এবং কোষগুলিকে আবার সাসপেন্ড করা হয়, 1000×g সেন্ট্রিফিউজ করা যেতে পারে 10 মিনিট পর সুপারনাট্যান্ট বাদ দেওয়ার পরে, সেল পেলেটটি ধাপ 2 এ এগিয়ে যায়)

2. সেল লাইসিস: বাফার সিএল সরান, এর তাপমাত্রা ঘরের তাপমাত্রার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, ডিএনএ ইরেজার এবং ফোরজিন প্রোটিজ প্লাস II, নিম্নলিখিত টেবিল 1-2 প্রস্তুত লাইসিস সিস্টেম অনুসারে: (লাইসিস সমাধান ব্যবহারের জন্য প্রস্তুত)।

সারণি 1-2: ফাটল সিস্টেম প্রস্তুতি (দ্রষ্টব্য: বরফের প্রস্তুতিতে)

3.(উদাহরণস্বরূপ 24 -ওয়েল প্লেট) প্রতিটি কূপের মধ্যে 200 μl সেল লাইসিস মাস্টার মিশ্রিত করুন, বারবার 5-10 বার ফুঁ দিন, 5 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় (20-25 ℃) ইনকিউবেট করুন।

বিঃদ্রঃ：বুদবুদ গঠন এড়াতে, অনুগ্রহ করে যখন পাইপেটিং পিপেট স্কেল 200μl বা তার কম সামঞ্জস্য করা হয়েছিল।লাইসিসের পরে কোষগুলি মেঘলা দেখা দিতে পারে, যা স্বাভাবিক।

4. (উদাহরণস্বরূপ 24 -ওয়েল প্লেট) তরল 20 μl বাফার ST যোগ করা হয় (টেবিল 1-3 এ দেখানো পরিমাণে বিভিন্ন lysis সিস্টেম বাফার ST যোগ করা হয়েছে) , 5-10 বার বার বার পাইপটিং, ঘরের তাপমাত্রায় (20-25 ℃) 2 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল।

বিঃদ্রঃ：পিপেটের টিপটি পৃষ্ঠের নীচে নিষ্পত্তি করা হয়, নিশ্চিত করে যে লাইসেট যোগ করা হয়েছে,বুদবুদ গঠন এড়াতে, অনুগ্রহ করে যখন pipetting Pipette স্কেল 200μl বা তার কম সমন্বয় করা হয়েছিল।

টেবিল 1-3：বাফার ST যোগ করুন

5. লাইসেট পরবর্তী RT-qPCR পরীক্ষার জন্য ব্যবহৃত হয়।পরবর্তী পরীক্ষাগুলো যদি সময়মতো করা না যায়, তাহলে অনুগ্রহ করে এটিকে বরফের ওপর 2 ঘণ্টার বেশি রাখুন এবং -20℃ বা -80 ℃ (তিন মাসের বেশি নয়) এ সংরক্ষণ করুন।

বি: আরটি সিস্টেম প্রস্তুতি

1. 5 × ডাইরেক্ট RT মিক্স বের করুন এবং এটি একটি বরফ স্নানের উপর রাখুন, এটি স্বাভাবিকভাবে গলতে দিন এবং পরে ব্যবহারের জন্য আলতো করে মেশান;RNase-Free ddH2O বের করে গলিয়ে নিন এবং পরে ব্যবহারের জন্য বরফের স্নানে রাখুন।নীচের সারণী 2-1 অনুযায়ী বরফের উপর প্রতিক্রিয়া সিস্টেম প্রস্তুত করুন।

সারণী 2-1: আরটি প্রতিক্রিয়া সিস্টেমের প্রস্তুতি

2. সিস্টেম প্রণয়ন সমাপ্তির পরে, নিম্নোক্ত সারণীতে সংক্ষিপ্তভাবে মিশ্রিত এবং কেন্দ্রীভূত করা হয় 2 -2 প্রতিক্রিয়া অবস্থা RT প্রতিক্রিয়া।

সারণি 2-2: RT প্রতিক্রিয়া শর্ত সেটিং

3. প্রতিক্রিয়া সমাপ্তির পরে, প্রতিক্রিয়া পণ্যটি qPCR এর জন্য সরাসরি বরফের উপর স্থাপন করা হয়েছিল, দয়া করে দীর্ঘমেয়াদী সংরক্ষণ -20℃ বা -80 ℃ রাখুন।

দ্রষ্টব্য: অ-বিশুদ্ধ টেমপ্লেট ব্যবহারের কারণে, বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন পণ্যে সাদা অবক্ষেপ দেখা যেতে পারে।এটি একটি স্বাভাবিক ঘটনা।পরবর্তী পরীক্ষা-নিরীক্ষার জন্য অবিলম্বে সুপারনাট্যান্টকে সেন্ট্রিফিউজ করুন।

ফলস্বরূপ RT প্রতিক্রিয়া সমাধান পরবর্তী ধাপের রিয়েল টাইম পিসিআর প্রতিক্রিয়া সিস্টেমে যোগ করা হয়, এটি প্রতিক্রিয়া সিস্টেমের 10-30% পর্যন্ত পরিমাণ যোগ করার সুপারিশ করা হয়।

C: qPCR প্রতিক্রিয়া সিস্টেম প্রস্তুতি

1. একটি প্রতিক্রিয়া সিস্টেম প্রস্তুত করার জন্য নিম্নলিখিত সারণী 3-1 অনুযায়ী ধাপে সিডিএনএ টেমপ্লেটে প্রস্তুতকৃত বি এর উপযুক্ত পরিমাণ।

দ্রষ্টব্য: cDNA টেমপ্লেটের পরিমাণ qPCR সিস্টেমের 10-30% জন্য দায়ী।উদাহরণস্বরূপ, একটি 20μl qPCR সিস্টেমে, 2-6 μl lysis বাফার যোগ করুন, কিন্তু 6 μl এর বেশি নয়।

2. qPCR প্রতিক্রিয়ার জন্য অপ্টিমাইজেশান ভাল qPCR শর্ত (অ্যানিলিং তাপমাত্রা，ইত্যাদি) (টেবিল 3-2 এ দেওয়া প্রতিক্রিয়া শর্তগুলি)।

দ্রষ্টব্য: ভাল ফলাফল পেতে qPCR প্রতিক্রিয়াগুলির জন্য অপ্টিমাইজ করা শর্তগুলি ব্যবহার করার চেষ্টা করুন।

সারণি 3-1: পিসিআর প্রতিক্রিয়া সিস্টেমের প্রস্তুতি

1*: প্রাইমারের ঘনত্ব 50-900 nM পরিসরে সামঞ্জস্য করা যেতে পারে যখন প্রাইমারের প্রতিক্রিয়া কার্যক্ষমতা খারাপ হয়।

দ্রষ্টব্য: qPCR সিস্টেম পরীক্ষামূলক প্রয়োজন এবং ফ্লুরোসেন্স সাইক্লার মডেল অনুযায়ী সামঞ্জস্য করা যেতে পারে।50-এ qPCR-এর জন্যμl সিস্টেম, 20 অনুযায়ী আনুপাতিকভাবে বিকারক ডোজ সামঞ্জস্য করুনμl সিস্টেম।

2*: ফ্লুরোসেন্স পরিমাণগত থার্মাল সাইক্লার অনুযায়ী ROX রেফারেন্স ডাই-এর উপযুক্ত চূড়ান্ত ঘনত্ব নির্বাচন করুন।সাধারণ ফ্লুরোসেন্স পরিমাণগত সাইক্লারদের জন্য সবচেয়ে উপযুক্ত ROX রেফারেন্স ডাই ঘনত্ব নীচের টেবিলে দেখানো হয়েছে:

সারণী 3-2: qPCR প্রতিক্রিয়া শর্ত প্রদান করা হয়

দ্রষ্টব্য: সেরা qPCR প্রভাব প্রাপ্ত করার জন্য, গ্রেডিয়েন্ট PCR বিভিন্ন টেমপ্লেট এবং বিভিন্ন প্রাইমারের প্রতিক্রিয়া শর্তগুলিকে অপ্টিমাইজ করতে ব্যবহার করা যেতে পারে।ফ্লুরোসেন্স বিশ্লেষক, টেমপ্লেট, প্রাইমার, ইত্যাদির উপর নির্ভর করে পিসিআর প্রতিক্রিয়ার শর্তগুলি পরিবর্তিত হয়৷ নির্দিষ্ট অপারেশনে, সর্বোত্তম প্রতিক্রিয়া শর্তগুলি ফ্লুরোসেন্স পরিমাণগত তাপীয় চক্রের নির্দিষ্ট অবস্থার উপর ভিত্তি করে ডিজাইন করা প্রয়োজন, টেমপ্লেটের ধরন, আগ্রহের খণ্ডের আকার, পরিবর্ধিত অংশের বেস সিকোয়েন্স, বিবর্ধিত প্রতিক্রিয়ার সময় এবং তাপমাত্রার দৈর্ঘ্য সহ তাপমাত্রা এবং জি.

রিয়েল টাইম পিসিআর প্রাইমার ডিজাইনের নীতি

ফরোয়ার্ড প্রাইমার এবং রিভার্স প্রাইমার

রিয়েল টাইম পিসিআর এর জন্য প্রাইমার ডিজাইন খুবই গুরুত্বপূর্ণ।প্রাইমারগুলি পিসিআর পরিবর্ধনের নির্দিষ্টতা এবং দক্ষতার সাথে সম্পর্কিত, এবং নিম্নলিখিত নীতিগুলির রেফারেন্স দিয়ে ডিজাইন করা যেতে পারে:

◆ প্রাইমারের দৈর্ঘ্য: 18-30bp।

◆ GC বিষয়বস্তু: 40-60%।

◆ Tm মান: প্রাইমার ডিজাইন সফ্টওয়্যার, যেমন প্রাইমার 5, প্রাইমারের Tm মান দিতে পারে।আপস্ট্রিম এবং ডাউনস্ট্রিম প্রাইমারের টিএম মান যতটা সম্ভব কাছাকাছি হওয়া উচিত।Tm গণনার সূত্রটিও ব্যবহার করা যেতে পারে: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T)।পিসিআর সম্পাদন করার সময়, প্রাইমার টিএম মানের 5 ডিগ্রি সেলসিয়াসের নীচে একটি তাপমাত্রা সাধারণত অ্যানিলিং তাপমাত্রা হিসাবে নির্বাচিত হয় (অ্যানিলিং তাপমাত্রার অনুরূপ বৃদ্ধি পিসিআর প্রতিক্রিয়ার নির্দিষ্টতা বাড়িয়ে তুলতে পারে)।

◆ প্রাইমার এবং পিসিআর পণ্য:

◆ ডিজাইন প্রাইমার পিসিআর পরিবর্ধন পণ্যের দৈর্ঘ্য 100-150bp হয়।

◆ টেমপ্লেটের সেকেন্ডারি স্ট্রাকচারাল এলাকায় ডিজাইন প্রাইমার যতটা সম্ভব এড়ানো উচিত।

◆ আপস্ট্রিম এবং ডাউনস্ট্রিম প্রাইমারের 3′ প্রান্তের মধ্যে 2 বা তার বেশি পরিপূরক ঘাঁটি তৈরি করা এড়িয়ে চলুন।

◆ প্রাইমার 3′ টার্মিনাল বেস 3টি অতিরিক্ত পরপর G বা C সহ উপস্থিত থাকতে পারে না।

◆ প্রাইমারগুলিতে পরিপূরক কাঠামো থাকতে পারে না, অন্যথায় একটি হেয়ারপিন গঠন তৈরি হবে, যা পিসিআর প্রশস্তকরণকে প্রভাবিত করবে।

◆ ATCG প্রাইমার সিকোয়েন্সে যতটা সম্ভব সমানভাবে বিতরণ করা উচিত, এবং 3′ টার্মিনাল বেস টি হিসাবে এড়ানো উচিত।

পরিশিষ্ট1：Cইল ডাইরেক্টRT-qPCR কিট উপাদানটি সম্পূরক প্যাক

1. সেল লাইসিস সমাধান