এটা সুপরিচিত যে কেন্দ্রীয় মতবাদে, আরএনএ হল ডিএনএ এবং প্রোটিন অভিব্যক্তির মধ্যে ট্রান্সক্রিপশনাল মধ্যস্থতাকারী।ডিএনএ সনাক্তকরণের সাথে তুলনা করে, আরএনএ সনাক্তকরণ জীবের জিনের অভিব্যক্তিকে আরও উদ্দেশ্যমূলকভাবে প্রতিফলিত করতে পারে।RNA-এর সাথে জড়িত পরীক্ষাগুলির মধ্যে রয়েছে: qRT-PCR, RNA-Seq, এবং ফিউশন জিন সনাক্তকরণ ইত্যাদি। RNA-এর বৈশিষ্ট্যের উপর ভিত্তি করে (RNA-এর চিনির রিং-এ DNA-এর চিনির রিং থেকে আরও একটি ফ্রি হাইড্রোক্সিল গ্রুপ রয়েছে), পরিবেশে প্রচুর RNase-এর সাথে মিলিত, RNA বেশি অস্থির এবং DNA-এর চেয়ে সহজতর।আবর্জনা ভিতরে, আবর্জনা আউট, যদি RNA এর গুণমান ভাল না হয়, তাহলে পরীক্ষামূলক ফলাফল অবশ্যই অসন্তুষ্ট হতে হবে, বিশেষত ভুল তথ্য বা দুর্বল পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা হিসাবে প্রকাশ করা হবে।অতএব, আরএনএ প্রক্রিয়াকরণে আরও মনোযোগ দেওয়া উচিত, এবং পরবর্তী পরীক্ষামূলক ডেটার নির্ভুলতা এবং নির্ভুলতা নিশ্চিত করার জন্য মান নিয়ন্ত্রণের লিঙ্কটি আরও গুরুত্বপূর্ণ।

আরএনএর মান নিয়ন্ত্রণের জন্য, সাধারণত নিম্নলিখিত সাধারণভাবে ব্যবহৃত পদ্ধতি রয়েছে:

• স্পেকট্রোফটোমেট্রি
• অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস
• Agilent Bioanalyzer
• রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর
• কিউবিট ফ্লুরোসেন্ট ডাই পদ্ধতি

01 স্পেকট্রোফটোমেট্রি

RNA এর সংযোজিত দ্বিগুণ বন্ধন রয়েছে এবং 260nm তরঙ্গদৈর্ঘ্যে একটি শোষণের শিখর রয়েছে।ল্যাম্বার্ট-বিয়ারের আইন অনুসারে, আমরা 260nm এ শোষণের শিখর থেকে RNA ঘনত্ব গণনা করতে পারি।উপরন্তু, আমরা 260nm, 280nm এবং 230nm শোষণ শিখর অনুপাত অনুযায়ী RNA এর বিশুদ্ধতা গণনা করতে পারি।280nm এবং 230nm হল যথাক্রমে প্রোটিন এবং ছোট অণুর শোষণের শিখর।A260/A280 এবং A260/A230 এর যোগ্য RNA বিশুদ্ধতার অনুপাত 2-এর বেশি হওয়া উচিত। যদি এটি 2-এর কম হয়, তাহলে এর অর্থ হল RNA নমুনায় প্রোটিন বা ছোট অণু দূষণ রয়েছে এবং আবার শুদ্ধ করা প্রয়োজন।দূষণের উত্সগুলি নিম্নধারার পরীক্ষাগুলিকে প্রভাবিত করবে, যেমন পিসিআর প্রতিক্রিয়াগুলির পরিবর্ধন দক্ষতাকে বাধা দেয়, যার ফলে ভুল পরিমাণগত ফলাফল হয়।RNA এর বিশুদ্ধতা পরবর্তী ফলাফলের উপর একটি বড় প্রভাব ফেলে, তাই স্পেকট্রোফটোমেট্রি সাধারণত নিউক্লিক অ্যাসিড পরীক্ষার প্রথম ধাপে একটি অপরিহার্য মান নিয়ন্ত্রণের লিঙ্ক।

চিত্র 1. সাধারণ RNA/DNA শোষণ বর্ণালী

02 অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস

বিশুদ্ধতার পাশাপাশি, আরএনএর অখণ্ডতাও আরএনএর গুণমান বিচার করার জন্য একটি গুরুত্বপূর্ণ সূচক।RNA-এর অবক্ষয় নমুনায় প্রচুর সংখ্যক ছোট খণ্ডের দিকে পরিচালিত করবে, তাই RNA খণ্ডের সংখ্যা যা কার্যকরভাবে সনাক্ত করা যায় এবং রেফারেন্স ক্রম দ্বারা আচ্ছাদিত করা যায় তা হ্রাস পাবে।1% অ্যাগারোজ জেলে মোট আরএনএর ইলেক্ট্রোফোরসিস দ্বারা RNA অখণ্ডতা পরীক্ষা করা যেতে পারে।এই পদ্ধতিটি নিজেই জেলটি কনফিগার করতে পারে, অথবা অখণ্ডতা পরীক্ষার জন্য পূর্বনির্মাণ করা E-Gel™ সিস্টেম ব্যবহার করতে পারে।মোট RNA এর 80% এরও বেশি হল রাইবোসোমাল RNA, যার অধিকাংশই 28S এবং 18S rRNA (স্তন্যপায়ী সিস্টেমে) দ্বারা গঠিত।ভাল মানের RNA দুটি সুস্পষ্ট উজ্জ্বল বার দেখাবে, যেগুলি যথাক্রমে 28S এবং 18S উজ্জ্বল বার, যথাক্রমে 5 Kb এবং 2 Kb, এবং অনুপাতটি 2:1 এর কাছাকাছি হবে।যদি এটি একটি বিচ্ছুরিত অবস্থায় থাকে, তাহলে এর অর্থ হল RNA নমুনা অবনমিত হতে পারে, এবং RNA এর গুণমান পরীক্ষা করার জন্য পরবর্তীতে বর্ণিত পদ্ধতি ব্যবহার করার পরামর্শ দেওয়া হয়।

চিত্র 2. অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরসিসে অবনমিত (লেন 2) এবং অক্ষত আরএনএ (লেন 3) এর তুলনা

03 Agilent Bioanalyzer

উপরে বর্ণিত অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস পদ্ধতির পাশাপাশি, যা আমাদের সহজভাবে এবং দ্রুত আরএনএর অখণ্ডতা সনাক্ত করতে সাহায্য করতে পারে, আমরা আরএনএর অখণ্ডতা নির্ধারণ করতে Agilent বায়োঅ্যানালাইজার ব্যবহার করতে পারি।এটি RNA ঘনত্ব এবং অখণ্ডতা মূল্যায়ন করতে মাইক্রোফ্লুইডিক্স, কৈশিক ইলেক্ট্রোফোরেসিস এবং ফ্লুরোসেন্সের সংমিশ্রণ ব্যবহার করে।RNA নমুনার প্রোফাইল বিশ্লেষণ করার জন্য অন্তর্নির্মিত অ্যালগরিদম ব্যবহার করে, Agilent bioanalyzer একটি রেফারেন্স RNA অখণ্ডতার মান, RNA ইন্টিগ্রিটি নম্বর (এরপরে RIN হিসাবে উল্লেখ করা হয়েছে) গণনা করতে পারে [1]।RIN-এর মান যত বড় হবে, RNA-এর অখণ্ডতা তত বেশি হবে (1 অত্যন্ত অবনমিত, 10 সবচেয়ে সম্পূর্ণ)।আরএনএ জড়িত কিছু পরীক্ষায় মানের মূল্যায়নের জন্য প্যারামিটার হিসাবে RIN ব্যবহার করার পরামর্শ দেওয়া হয়।উদাহরণ হিসাবে উচ্চ-থ্রুপুট সিকোয়েন্সিং পরীক্ষাগুলি (এরপরে এনজিএস হিসাবে উল্লেখ করা হয়েছে) নেওয়া, অনকমাইন ™ হিউম্যান ইমিউন রেপারটোয়ারের নির্দেশিকা, যা থার্মো ফিশারের অনকোমাইন প্যানেল সিরিজে বি সেল এবং টি সেল অ্যান্টিজেন রিসেপ্টর সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়, পরামর্শ দেয় যে RIN মান সহ নমুনাগুলি 4, 3 এবং এফ-এর থেকে বেশি পরিমাপ করা যেতে পারে।বিভিন্ন প্যানেলের জন্য বিভিন্ন প্রস্তাবিত রেঞ্জ রয়েছে এবং প্রায়শই উচ্চতর RIN আরও কার্যকর ডেটা আনতে পারে।

চিত্র 3, Oncomine™ হিউম্যান ইমিউন রিপারটোয়ার পরীক্ষায়, 4-এর বেশি RIN সহ নমুনাগুলি আরও কার্যকর রিড এবং টি সেল ক্লোন সনাক্ত করতে পারে।【2】

যাইহোক, RIN মানটিরও কিছু সীমাবদ্ধতা রয়েছে।যদিও এনজিএস পরীক্ষামূলক ডেটার মানের সাথে RIN-এর একটি উচ্চ সম্পর্ক রয়েছে, তবে এটি FFPE নমুনার জন্য উপযুক্ত নয়।এফএফপিই নমুনাগুলি দীর্ঘদিন ধরে রাসায়নিকভাবে চিকিত্সা করা হয়েছে, এবং নিষ্কাশিত আরএনএ সাধারণত তুলনামূলকভাবে কম RIN মান থাকে।যাইহোক, এর অর্থ এই নয় যে পরীক্ষার কার্যকরী ডেটা অসন্তোষজনক হতে হবে।FFPE নমুনার গুণমান সঠিকভাবে মূল্যায়ন করার জন্য, আমাদের RIN ছাড়া অন্য পরিমাপ ব্যবহার করতে হবে।RIN ছাড়াও, Agilent bioanalyzer RNA মানের মূল্যায়ন পরামিতি হিসাবে DV200 মানও গণনা করতে পারে।DV200 হল একটি প্যারামিটার যা একটি RNA নমুনায় 200 bp-এর চেয়ে বড় অংশের অনুপাত গণনা করে।DV200 হল RIN এর চেয়ে FFPE নমুনার মানের একটি ভাল সূচক।এফএফপিই দ্বারা নিষ্কাশিত আরএনএর জন্য, এটি কার্যকরভাবে সনাক্ত করা যায় এমন জিনের সংখ্যা এবং জিনের বৈচিত্র্যের সাথে খুব উচ্চ সম্পর্ক রয়েছে [3]।যদিও DV200 FFPE-এর গুণমান শনাক্তকরণের ঘাটতি পূরণ করতে পারে, তবুও Agilent bioanalyzer এখনও RNA নমুনার মানের সমস্যাগুলি বিস্তৃতভাবে বিশ্লেষণ করতে পারে না, এর মধ্যে নমুনাগুলিতে ইনহিবিটার আছে কিনা।ইনহিবিটাররা নিজেরাই ডাউনস্ট্রিম পরীক্ষার পরিবর্ধন দক্ষতাকে প্রভাবিত করতে পারে এবং দরকারী ডেটার পরিমাণ কমাতে পারে।নমুনায় কোনো ইনহিবিটার আছে কিনা তা জানতে, আমরা পরবর্তীতে বর্ণিত রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর পদ্ধতি অবলম্বন করতে পারি।

04 রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর

রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর পদ্ধতি শুধুমাত্র নমুনায় ইনহিবিটর সনাক্ত করতে পারে না, তবে এফএফপিই নমুনায় আরএনএর গুণমানকে সঠিকভাবে প্রতিফলিত করতে পারে।Agilent জৈবিক বিশ্লেষকদের সাথে তুলনা করে, রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্স পরিমাণগত যন্ত্রগুলি তাদের ব্যাপক প্রয়োগের কারণে প্রধান জৈবিক পরীক্ষাগারগুলিতে আরও জনপ্রিয়।আরএনএ নমুনার গুণমান পরীক্ষা করার জন্য, আমাদের শুধুমাত্র অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিনের জন্য প্রাইমার প্রোব কিনতে বা প্রস্তুত করতে হবে, যেমন GUSB (Cat no. Hs00939627)।নিখুঁত পরিমাণগত পরীক্ষা চালানোর জন্য প্রাইমার, প্রোব এবং স্ট্যান্ডার্ডের এই সেট (পরিচিত ঘনত্বের মোট RNA) ব্যবহার করে, কার্যকর RNA খণ্ডের ঘনত্বকে RNA মানের মূল্যায়ন মান হিসাবে গণনা করা যেতে পারে (সংক্ষেপে কার্যকরী RNA কোয়ান্টিটেশন (FRQ))।একটি NGS পরীক্ষায়, আমরা দেখতে পেয়েছি যে RNA নমুনার FRQ এর কার্যকরী ডেটা ভলিউমের সাথে খুব উচ্চ সম্পর্ক রয়েছে।0.2ng/uL FRQ-এর বেশি সব নমুনার জন্য, কমপক্ষে 70% রিড কার্যকরভাবে রেফারেন্স সিকোয়েন্সকে কভার করতে পারে (চিত্র 4)।

চিত্র 4, ফ্লুরোসেন্স পরিমাণগত পদ্ধতি দ্বারা সনাক্ত করা FRQ মানটির NGS পরীক্ষায় প্রাপ্ত কার্যকর ডেটার সাথে একটি খুব উচ্চ সম্পর্ক রয়েছে (R2>0.9)।লাল রেখা হল FRQ মান 0.2 ng/uL (log10 = -0.7) এর সমান।【4】

এফএফপিই নমুনার ক্ষেত্রে প্রযোজ্য হওয়ার পাশাপাশি, রিয়েল-টাইম পরিমাণগত পিসিআর পদ্ধতি কার্যকরভাবে নমুনাগুলিতে ইনহিবিটারগুলিকে নিরীক্ষণ করতে পারে।আমরা অভ্যন্তরীণ পজিটিভ কন্ট্রোল (IPC) এবং এর অ্যাসে সহ প্রতিক্রিয়া সিস্টেমে সনাক্ত করার জন্য নমুনা যোগ করতে পারি এবং তারপরে Ct মান পেতে ফ্লুরোসেন্স পরিমাণ নির্ধারণ করতে পারি।নো-স্যাম্পল বিক্রিয়ায় যদি Ct মান Ct মানের থেকে পিছিয়ে থাকে, তাহলে এটি নির্দেশ করে যে ইনহিবিটরটি নমুনায় উপস্থিত রয়েছে এবং বিক্রিয়ায় পরিবর্ধন দক্ষতাকে বাধা দেয়।

05 কিউবিট ফ্লুরোসেন্ট ডাই পদ্ধতি

কিউবিট ফ্লুরোমিটার হল নিউক্লিক অ্যাসিড ঘনত্ব এবং বিশুদ্ধতা সনাক্তকরণের জন্য সর্বাধিক ব্যবহৃত ছোট ডিভাইস, যা পরিচালনা করা সহজ এবং প্রায় প্রতিটি আণবিক জীববিজ্ঞান পরীক্ষাগারে বিদ্যমান।এটি সনাক্তকরণ এবং নিউক্লিক অ্যাসিড-বাইন্ডিং ফ্লুরোসেন্ট ডাই (কিউবিট সনাক্তকরণ বিকারক) দ্বারা নিউক্লিক অ্যাসিডের ঘনত্ব সঠিকভাবে গণনা করে।কিউবিটের উচ্চ সংবেদনশীলতা এবং নির্দিষ্টতা রয়েছে এবং এটি সঠিকভাবে RNA-কে pg/µL ঘনত্ব পর্যন্ত পরিমাপ করতে পারে।নিউক্লিক অ্যাসিডের ঘনত্ব সঠিকভাবে পরিমাপ করার সুপরিচিত ক্ষমতা ছাড়াও, থার্মো ফিশারের সর্বশেষ নতুন মডেল, কিউবিট 4.0, আরএনএর অখণ্ডতাও সনাক্ত করতে পারে।Qubit 4.0′-এর RNA সনাক্তকরণ সিস্টেম (RNA IQ Assay) একই সাথে দুটি নির্দিষ্ট ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জক সনাক্ত করে RNA এর অখণ্ডতা সনাক্ত করে।এই দুটি ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জক যথাক্রমে বড় টুকরো এবং RNA এর ছোট টুকরোগুলির সাথে আবদ্ধ হতে পারে।এই দুটি ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জক নমুনায় RNA-এর বৃহৎ অংশের অনুপাত নির্দেশ করে এবং এর থেকে RNA মানের প্রতিনিধিত্বকারী IQ (Integrity and Quality) মান গণনা করা যেতে পারে।IQ মান এফএফপিই এবং নন-এফএফপিই উভয় নমুনার ক্ষেত্রেই প্রযোজ্য, এবং পরবর্তী সিকোয়েন্সিং মানের উপর দারুণ প্রভাব ফেলে।NGS পরীক্ষাগুলিকে উদাহরণ হিসাবে নিলে, Ion torrent™ প্ল্যাটফর্মে সম্পাদিত RNA-Seq পরীক্ষা পরীক্ষায়, 4-এর বেশি আইকিউ মান সহ বেশিরভাগ নমুনার অন্তত 50% কার্যকরী পাঠ ছিল (চিত্র 5)।উপরে উল্লিখিত সনাক্তকরণ পদ্ধতির সাথে তুলনা করে, Qubit IQ Assay শুধুমাত্র কাজ করার জন্য আরও সুবিধাজনক নয় এবং কম সময় নেয় (পাঁচ মিনিটের মধ্যে), তবে মাপা পরামিতি IQ মান এবং ডাউনস্ট্রিম পরীক্ষাগুলির ডেটা মানের মধ্যে একটি দুর্দান্ত সম্পর্ক রয়েছে৷

চিত্র 5, Qubit RNA IQ মান এবং RNA-Seq এর ম্যাপড রিডের মধ্যে একটি দুর্দান্ত সম্পর্ক রয়েছে।【5】

উপরোক্ত ভূমিকার মাধ্যমে, আমি বিশ্বাস করি যে প্রত্যেকেরই বিভিন্ন RNA মান নিয়ন্ত্রণ পদ্ধতি সম্পর্কে যথেষ্ট ধারণা রয়েছে।অনুশীলনে, আপনি চয়ন করতে পারেননমুনার ধরন এবং বিদ্যমান যন্ত্র অনুযায়ী সংশ্লিষ্ট পদ্ধতি।শুধুমাত্র আরএনএ-এর গুণমান নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে আমরা নিম্নমানের নমুনার গুণমানের কারণে পরবর্তী পরীক্ষা-নিরীক্ষার ব্যর্থতা এড়াতে পারি, এইভাবে মূল্যবান সময়, শক্তি এবং খরচ বাঁচাতে পারি।

রেফারেন্স পণ্য:

পশু মোট RNA বিচ্ছিন্নতা কিট

সেল টোটাল আরএনএ আইসোলেশন কিট

তথ্যসূত্র

【1】শ্রোডার, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: RNA পরিমাপের অখণ্ডতার মান নির্ধারণের জন্য একটি RNA অখণ্ডতা নম্বর।BMC মলিকুলার বায়োল 7, 3 (2006)।https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】আনকামাইন হিউম্যান ইমিউন রিপারটোয়ার ইউজার গাইড (পাব নং MAN0017438 Rev. C.0)।

【3】লিয়াহ সি ওয়েহমাস, চার্লস ই উড, ব্রায়ান এন চোরলি, ক্যারোল এল ইয়াউক, গেইল এম নেলসন, সুসান ডি হেস্টার, আর্কাইভাল ফরমালিন-ফিক্সড প্যারাফিন-এমবেডেড টিস্যু নমুনা থেকে প্রাপ্ত আরএনএ মূল্যায়নের জন্য উন্নত গুণমান মেট্রিক্স, পৃষ্ঠা 20, টক্সিকোলজিক্যাল বিজ্ঞান, পৃষ্ঠা 20, পৃষ্ঠা 20, 1 357-373,https://doi.org/10.1093/toxsci/