সনাক্তকরণের নির্দিষ্টতা

বেশিরভাগ ক্ষেত্রে, প্রাইমার ডিজাইনের উদ্দেশ্য হল পিসিআর-এর নির্দিষ্টতা সর্বাধিক করা।এটি অনেকগুলি ভেরিয়েবলের কম বা কম অনুমানযোগ্য প্রভাব দ্বারা নির্ধারিত হয়।একটি গুরুত্বপূর্ণ পরিবর্তনশীল হল প্রাইমারের 3′প্রান্তে অনুক্রম।

গুরুত্বপূর্ণভাবে, নির্দিষ্টতার জন্য ডিজাইন করা পিসিআর অ্যাসেগুলি বিস্তৃত গতিশীল পরিসরে উচ্চ দক্ষতা বজায় রাখার সম্ভাবনা বেশি, কারণ অ্যাস অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন পণ্য তৈরি করে না, যার ফলে পিসিআর রিএজেন্টগুলির সাথে প্রতিযোগিতা করে বা প্রধান পরিবর্ধন প্রতিক্রিয়াকে বাধা দেয়।

অবশ্যই, কিছু ক্ষেত্রে, নির্দিষ্টতা সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ নয়, উদাহরণস্বরূপ, যখন লক্ষ্য ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত কিন্তু বিভিন্ন রোগজীবাণুকে পরিমাপ করা হয়, বিশেষ নকশা, অপ্টিমাইজেশান এবং যাচাইকরণ মান প্রয়োজন হয়।

গলানো বক্ররেখা হল অ্যামপ্লিকনগুলির নির্দিষ্টতা মূল্যায়নের জন্য একটি আদর্শ পদ্ধতি, অন্ততপক্ষে একটি একক লক্ষ্যকে প্রসারিত করতে হবে কিনা।যাইহোক, এটি অবশ্যই জোর দেওয়া উচিত যে গলে যাওয়া বক্ররেখাগুলি বিভ্রান্তিকর হতে পারে কারণ, উদাহরণস্বরূপ, তারা সাবঅপ্টিমাল প্রাইমার এবং কম টেমপ্লেট ঘনত্বের সম্মিলিত প্রভাব দ্বারা প্রভাবিত হতে পারে।

P5 |গলে যাওয়া বক্ররেখা দুটি লক্ষ্য ডিএনএ-এর বিভিন্ন পরিমাণের দুটি সনাক্তকরণ থেকে প্রাপ্ত টিএম স্থানান্তর দেখায়।

উ: উচ্চ ঘনত্বে (বিজ্ঞাপন)), qPCR পরিমাপ সম্পূর্ণ হওয়ার পরে কোনও স্পষ্ট প্রাইমার ডাইমার নেই।টেমপ্লেটের ঘনত্ব 50 কপি (e) এ কমে যাওয়ার সাথে সাথে একটি অ-নির্দিষ্ট পণ্য প্রদর্শিত হতে শুরু করে এবং সর্বনিম্ন ঘনত্ব (f) এ একমাত্র পণ্য হয়ে ওঠে।

B. পরীক্ষাটি সমস্ত লক্ষ্য ঘনত্বে একই Tms রেকর্ড করেছে, এবং সর্বনিম্ন ঘনত্বেও (5 কপি) কোনো স্পষ্ট প্রাইমার ডাইমার ছিল না।এই দুটি সনাক্তকরণ পদ্ধতি ব্যবহার করার সময়, এনটিসিগুলিতে কোনও পরিবর্ধন পণ্য সনাক্ত করা যায়নি।

P5 নমুনার সাথে প্রাপ্ত দ্রবীভূত বক্ররেখা দেখায় যেখানে টেমপ্লেটটি বিভিন্ন ঘনত্বে উপস্থিত থাকে।P 5a দেখায় যে দুটি সর্বনিম্ন ঘনত্বে, উত্পাদিত অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন পণ্যগুলির Tms নির্দিষ্ট অ্যামপ্লিকনগুলির তুলনায় কম।

স্পষ্টতই, এই সনাক্তকরণ পদ্ধতিটি কম ঘনত্বে বিদ্যমান লক্ষ্যগুলি সনাক্ত করতে নির্ভরযোগ্যভাবে ব্যবহার করা যাবে না।

মজার বিষয় হল, এনটিসি, অর্থাৎ, কোন ডিএনএ ছাড়া নমুনাগুলি রেকর্ড করেনি (অ-নির্দিষ্ট) পরিবর্ধন পণ্য, যা নির্দেশ করে যে পটভূমি জিনোমিক ডিএনএ অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন/পলিমারাইজেশনে অংশগ্রহণ করতে পারে।

কখনও কখনও এই ধরনের ব্যাকগ্রাউন্ড প্রাইমার এবং অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনের প্রতিকার করা যায় না, তবে প্রায়শই এমন একটি সনাক্তকরণ পদ্ধতি ডিজাইন করা সম্ভব যেটিতে কোনও টেমপ্লেট ঘনত্ব এবং NTC (P 5b) এ অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন নেই।

এখানে, এমনকি 35 এর Cq দিয়ে লক্ষ্য ঘনত্বের পরিবর্ধন রেকর্ড করা একটি নির্দিষ্ট দ্রবীভূত বক্ররেখা তৈরি করবে।একইভাবে, এনটিসিগুলি অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনের কোনও লক্ষণ দেখায়নি।কখনও কখনও, সনাক্তকরণ আচরণ মাদার লিকারের উপর নির্ভরশীল হতে পারে, এবং শুধুমাত্র অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন কিছু নির্দিষ্ট বাফার রচনায় সনাক্ত করা হয়, যা বিভিন্ন Mg2+ ঘনত্বের সাথে সম্পর্কিত হতে পারে।

সনাক্তকরণের স্থায়িত্ব

Ta-এর অপ্টিমাইজেশন qPCR সনাক্তকরণের অভিজ্ঞতামূলক যাচাইকরণ এবং অপ্টিমাইজেশন প্রক্রিয়ার একটি দরকারী পদক্ষেপ।এটি তাপমাত্রা (বা তাপমাত্রা পরিসীমা) দেখিয়ে প্রাইমার সেটের মজবুততার একটি প্রত্যক্ষ ইঙ্গিত প্রদান করে যা NTC প্রশস্ত না করে সর্বনিম্ন Cq উৎপন্ন করে।

সংবেদনশীলতার দুই থেকে চারগুণ পার্থক্য উচ্চ mRNA এক্সপ্রেশনের লোকেদের জন্য গুরুত্বপূর্ণ নাও হতে পারে, কিন্তু ডায়াগনস্টিক পরীক্ষার জন্য, এর অর্থ ইতিবাচক এবং মিথ্যা নেতিবাচক ফলাফলের মধ্যে পার্থক্য হতে পারে।

qPCR প্রাইমারের Ta বৈশিষ্ট্য ব্যাপকভাবে পরিবর্তিত হতে পারে।কিছু পরীক্ষা খুব শক্তিশালী নয়, এবং যদি সেগুলি প্রাইমারের সর্বোত্তম Ta মানের অধীনে সঞ্চালিত না হয় তবে সেগুলি দ্রুত ভেঙে পড়বে।

এটি গুরুত্বপূর্ণ কারণ এই ধরনের সনাক্তকরণ প্রায়ই বাস্তব জগতে সমস্যাযুক্ত হয় এবং নমুনার বিশুদ্ধতা, ডিএনএর ঘনত্ব বা অন্যান্য ডিএনএর উপস্থিতি সর্বোত্তম নাও হতে পারে।

উপরন্তু, টার্গেট কপি নম্বর বিস্তৃত পরিসরে পরিবর্তিত হতে পারে, এবং বিকারক, প্লাস্টিকের পাত্র বা যন্ত্রগুলি পরীক্ষা সেট আপ করার সময় ব্যবহৃত হওয়া থেকে আলাদা হতে পারে।

P6|তাপমাত্রার গ্রেডিয়েন্ট পিসিআর সনাক্তকরণের বিভিন্ন দৃঢ়তা দেখায়।

A. মানব মস্তিষ্কের RNA থেকে তৈরি cDNA-তে PCR সঞ্চালনের জন্য Bioline's Sensifast SYBR মাস্টারমিক্স (ক্যাটালগ নম্বর BIO-98050) ব্যবহার করুন।

B. অ্যাপলিনের পরিবর্ধন মানচিত্র এবং দ্রবীভূত বক্ররেখা রেকর্ড করতে Bio-Rad-এর CFX qPCR যন্ত্র ব্যবহার করুন (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGTGATCTCCTAGG)।

C. ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG) এর প্রশস্তকরণ গ্রাফ এবং গলন বক্ররেখা।

D. GFAP এর পরিবর্ধন গ্রাফ এবং দ্রবীভূত বক্ররেখা (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCTCGTGGATCTTC)।

E. বিভিন্ন অ্যানিলিং তাপমাত্রায় রেকর্ড করা Cqs, 7C তাপমাত্রা গ্রেডিয়েন্টের অধীনে রেকর্ড করা Cq-এর পার্থক্য দেখায়।

P 6 একটি অবাঞ্ছিত পরীক্ষার একটি সাধারণ ফলাফল দেখায়, যেখানে qPCR 59C এবং 67C (P 6a) এর মধ্যে গ্রেডিয়েন্ট Tas ব্যবহার করে তিনটি মানুষের মস্তিষ্ক-নির্দিষ্ট জিনের জন্য প্রাইমার ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল।

পরিবর্ধন গ্রাফ থেকে দেখা যায় যে ওপ্যালিন প্রাইমারগুলি আদর্শ থেকে অনেক দূরে কারণ তাদের সর্বোত্তম Ta পরিসীমা খুব সংকীর্ণ (চিত্র 6b), অর্থাৎ, Cqs ব্যাপকভাবে বিচ্ছুরিত হয়, যার ফলে Cqগুলি তাদের সর্বোত্তম Cqs কমের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে তুলনা করা হয়।

এই সনাক্তকরণ পদ্ধতি অস্থির এবং সাবঅপ্টিমাল অ্যামপ্লিফিকেশন হতে পারে।অতএব, প্রাইমারের এই জোড়া পুনরায় ডিজাইন করা উচিত।উপরন্তু, গলে যাওয়া বক্ররেখা বিশ্লেষণ (ইনসেট) দেখায় যে এই সনাক্তকরণ পদ্ধতির নির্দিষ্টতাও সমস্যাযুক্ত হতে পারে, কারণ প্রতিটি Ta এর গলন বক্ররেখা আলাদা।

P 6c তে দেখানো ACSBG1 সনাক্তকরণ পদ্ধতিটি উপরের Opalin সনাক্তকরণ পদ্ধতির চেয়ে আরও শক্তিশালী, তবে এটি এখনও আদর্শ থেকে অনেক দূরে, এবং সম্ভবত এটি উন্নত করা যেতে পারে।

যাইহোক, আমরা জোর দিয়েছি যে দৃঢ়তা এবং নির্দিষ্টতার মধ্যে কোন প্রয়োজনীয় সংযোগ নেই, কারণ এই সনাক্তকরণ পদ্ধতি দ্বারা উত্পাদিত দ্রবীভূত বক্ররেখা সমস্ত Tas (ইনসেট) এ একই সর্বোচ্চ মান দেখায়।

অন্যদিকে, দৃঢ়তা পরীক্ষা অনেক বেশি সহনশীল, বিস্তৃত Tas-এ একই রকম Cq তৈরি করে, যেমন P 6d-এ দেখানো GFAP পরীক্ষায়।

একই 8 ডিগ্রি সেলসিয়াস পরিসরে প্রাপ্ত Cqs-এর পার্থক্য 1-এর কম, এবং দ্রবীভূত বক্ররেখা (ইনসেট) এই তাপমাত্রা পরিসরে সনাক্তকরণের বৈশিষ্ট্যগুলি নিশ্চিত করে৷এটি লক্ষণীয় যে গণনা করা Tas এবং প্রকৃত Ta পরিসীমা খুব আলাদা হতে পারে।

গবেষকদের দক্ষ প্রাইমার ডিজাইন করতে সাহায্য করার জন্য ডিজাইন করা অনেক নির্দেশিকা রয়েছে, যার বেশিরভাগই দীর্ঘ-স্থাপিত নিয়মের উপর ভিত্তি করে এবং প্রাইমারের 3′প্রান্তে অনেক মনোযোগ দেওয়া হয়েছে।প্রায়শই 3'র শেষে একটি G বা C এবং দুটি G বা C বেস (GC ক্ল্যাম্প) অন্তর্ভুক্ত করার পরামর্শ দেওয়া হয়, তবে শেষ 5টি ঘাঁটির মধ্যে দুটির বেশি নয়।

বাস্তবে, এই নিয়মগুলি গবেষকদের গাইড করতে পারে, কিন্তু সেগুলি সব পরিস্থিতিতেই সঠিক নয়।

P7 |প্রাইমারের 3′প্রান্তের নির্দিষ্টতা বা দক্ষতার উপর খুব কম প্রভাব পড়ে।

উ: মানুষের HIF-1α (NM_181054.2) জিনের জন্য প্রাইমারের অবস্থান।

B. ছয়টি টেস্ট আইটেম প্রসারিত করতে Agilent Brilliant III SYBR গ্রিন মাদার লিকার (বিড়াল নং 600882) ব্যবহার করুন।

C. বায়ো-র্যাড-এর CFX qPCR যন্ত্র এবং 3′এন্ড প্রাইমার দ্বারা রেকর্ডকৃত পরিবর্ধন গ্রাফ এবং গলে যাওয়া বক্ররেখা।এনটিসি লাল রঙে দেখানো হয়েছে।

D. প্রতিটি পরীক্ষার আইটেমের Cqs রেকর্ড

উদাহরণস্বরূপ, P 7-এর ফলাফল 3′শেষের নিয়মের বিপরীত।সমস্ত ডিজাইনই মূলত একই ফলাফল দেয়, শুধুমাত্র দুটি প্রাইমারের সংমিশ্রণ NTC-তে অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনের দিকে পরিচালিত করে।

যাইহোক, আমরা GC ক্লিপের প্রভাবকে সমর্থন করতে পারি না, কারণ এই ক্ষেত্রে, A বা T সর্বাধিক 30 বেস হিসাবে ব্যবহার করলে নির্দিষ্টতা কমে না।

টেস্ট C, যেখানে F প্রাইমার GGCC-এ শেষ হয়, NTC-তে Cqs রেকর্ড করেছে, যা নির্দেশ করে যে কেউ হয়তো 30-এন্ডে এই সিকোয়েন্সগুলি এড়াতে চাইবে।আমরা জোর দিই যে প্রাইমার জোড়ার সেরা 3′শেষ ক্রম নির্ধারণের একমাত্র উপায় হল পরীক্ষামূলকভাবে কিছু প্রার্থী প্রাইমার মূল্যায়ন করা।

পরিবর্ধন দক্ষতা

গুরুত্বপূর্ণভাবে, যদিও অ-নির্দিষ্ট পিসিআর সনাক্তকরণ কখনই সুনির্দিষ্ট হতে পারে না, এনজাইম, মাদার লিকার, অ্যাডিটিভস এবং সাইক্লিং অবস্থার পরিবর্তন করে বিভিন্ন উপায়ে পরিবর্ধন কার্যকারিতা সামঞ্জস্য এবং সর্বাধিক করা যেতে পারে।

পিসিআর সনাক্তকরণের কার্যকারিতা মূল্যায়ন করার জন্য, লক্ষ্য নিউক্লিক অ্যাসিডের 10 বা 5 গুণ সিরিয়াল ডিলিউশন ব্যবহার করা ভাল, অর্থাৎ "স্ট্যান্ডার্ড কার্ভ পদ্ধতি"।

যদি পিসিআর অ্যামপ্লিকন বা সিন্থেটিক ডিএনএ লক্ষ্যগুলি একটি আদর্শ বক্ররেখা তৈরি করতে ব্যবহার করা হয়, তবে এই লক্ষ্যগুলির সিরিয়াল ডিলিউশনগুলিকে স্থির পরিমাণ ব্যাকগ্রাউন্ড ডিএনএ (যেমন জিনোমিক ডিএনএ) এর সাথে মিশ্রিত করা উচিত।

P8 |PCR এর কার্যকারিতা মূল্যায়ন করার জন্য পাতলা বক্ররেখা।

A. HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA এবং R: TGTCCTGTGTGGTGACTTGTCC এবং Agilent's Brilliant III SYBR গ্রীন মাস্টারমিক্স (ক্যাটালগ নম্বর 600882) পিসিআর এবং গলে যাওয়া বক্ররেখা অবস্থার জন্য প্রাইমার ব্যবহার করুন।

B. 100 ng RNA বিপরীত প্রতিলিপি করা হয়েছিল, 2 বার পাতলা করা হয়েছিল এবং ক্রমিকভাবে মিশ্রিত সিডিএনএ নমুনাগুলি 5 বার 1 এনজি মানব জিনোমিক ডিএনএতে পাতলা করা হয়েছিল।গলে যাওয়া বক্ররেখা ইনসেটে দেখানো হয়েছে।

C. দ্বিতীয় সিডিএনএ নমুনার জন্য আরটি প্রতিক্রিয়া, তরলীকরণ এবং সিরিয়াল তরলীকরণ পুনরাবৃত্তি করা হয়েছিল এবং ফলাফলগুলি একই রকম ছিল।

P 8 দুটি স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখা দেখায়, দুটি ভিন্ন cDNA নমুনায় একই সনাক্তকরণ পদ্ধতি ব্যবহার করে, ফলাফল একই দক্ষতা, প্রায় 100%, এবং R2 মানটিও একই রকম, অর্থাৎ, পরীক্ষামূলক ডেটা এবং রিগ্রেশন লাইনের মধ্যে ফিট ডিগ্রী বা ডেটা ডিগ্রী অফ লিনিয়ারিটি।

দুটি আদর্শ বক্ররেখা তুলনামূলক, কিন্তু ঠিক একই নয়।যদি উদ্দেশ্যটি সঠিকভাবে লক্ষ্যমাত্রা পরিমাপ করা হয়, তবে এটি অবশ্যই উল্লেখ করা উচিত যে অনিশ্চয়তা ব্যাখ্যা না করে একটি কপি নম্বর গণনা প্রদান করা অগ্রহণযোগ্য।

P9 |একটি মানক বক্ররেখা ব্যবহার করে পরিমাপের অনিশ্চয়তা পরিমাপের সাথে সম্পর্কিত.

A. PCR এবং গলানো বক্ররেখার অবস্থা সঞ্চালনের জন্য GAPDH (NM_002046) এর জন্য প্রাইমার ব্যবহার করুন।F: ACAGTTGCCATGTAGACC এবং R: TAACTGGTTGAGCACAGG এবং বায়োলাইনের সেনসিফাস্ট SYBR মাস্টারমিক্স (ক্যাটালগ নম্বর BIO-98050)।

B. বায়ো-র্যাড-এর CFX qPCR যন্ত্রের সাহায্যে বিবর্ধন চার্ট, গলানো বক্ররেখা এবং স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখা।

C. স্ট্যান্ডার্ড কার্ভ গ্রাফ এবং 95% কনফিডেন্স ইন্টারভাল (CI)।

D. কপি নম্বর এবং 95% আত্মবিশ্বাসের ব্যবধান তিনটি Cq মানের তরল বক্ররেখা থেকে প্রাপ্ত।

P 9 দেখায় যে একটি অপ্টিমাইজ করা পরীক্ষার জন্য, একটি একক স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখার অন্তর্নিহিত পরিবর্তনশীলতা প্রায় 2 গুণ (95% আত্মবিশ্বাসের ব্যবধান, সর্বনিম্ন থেকে সর্বোচ্চ), যা আশা করা যেতে পারে এমন ক্ষুদ্রতম পরিবর্তনশীলতা হতে পারে।

সংশ্লিষ্ট পণ্য:

সেল ডাইরেক্ট আরটি qPCR কিট

মাউস টেইল ডাইরেক্ট পিসিআর কিট

প্রাণীর টিস্যু ডাইরেক্ট পিসিআর কিট