RT-qPCR পরীক্ষায় রয়েছে RNA নিষ্কাশন এবং গুণমান মূল্যায়ন, বিপরীত প্রতিলিপি এবং qPCR তিনটি ধাপ, প্রতিটি ধাপে অনেক সতর্কতা রয়েছে, আমরা নীচে বিস্তারিতভাবে পরিচয় করিয়ে দেব।
Ⅰআরএনএ মানের মূল্যায়ন
RT-qPCR পরীক্ষায়, RNA নিষ্কাশন শেষ হওয়ার পরে, RNA-এর গুণমান মূল্যায়ন করা প্রয়োজন, এবং ফলো-আপ পরীক্ষা শুধুমাত্র যোগ্যতা অর্জনের পরেই করা যেতে পারে।মূল্যায়ন পদ্ধতির মধ্যে রয়েছে স্পেকট্রোফটোমিটার, এজিলেন্ট জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস, এজিলেন্ট 2100 বিশ্লেষণ, যার মধ্যে সবচেয়ে বেশি ব্যবহৃত স্পেকট্রোফোটোমিটার এবং অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস পদ্ধতি সনাক্তকরণ।এটি লক্ষ করা উচিত যে RNA ঘনত্ব, বিশুদ্ধতা এবং অখণ্ডতা সনাক্তকরণ এবং বিশ্লেষণ সম্পূর্ণ করতে এই দুটি পদ্ধতি একসাথে ব্যবহার করা প্রয়োজন, যাতে RNA-এর গুণমান নিশ্চিত করা যায়।
সম্পর্কিত আরএনএ আইসোলেশন কিট:
উচ্চ শুদ্ধ এবং উচ্চ মানের মোট RNA বিভিন্ন সংস্কৃত কোষ থেকে 11 মিনিটের মধ্যে পাওয়া যেতে পারে।
বিভিন্ন প্রাণীর টিস্যু থেকে দ্রুত এবং দক্ষতার সাথে উচ্চ-বিশুদ্ধতা এবং উচ্চ-মানের মোট RNA বের করুন।
স্পেকট্রোফটোমিটার:
স্পেকট্রোফটোমিটার প্রধানত RNA এর ঘনত্ব এবং বিশুদ্ধতা নির্ধারণ করতে ব্যবহৃত হয়, কিন্তু এটি RNA এবং জিনোমিক অবশিষ্টাংশের অখণ্ডতা সনাক্ত করতে পারে না।তাদের মধ্যে, A260/280 এবং A260/230 হল RNA বিশুদ্ধতা সনাক্তকরণের জন্য গুরুত্বপূর্ণ পরামিতি, এবং RNA বিশুদ্ধতা তাদের মানগুলির ওঠানামা অনুসারে সনাক্ত করা যেতে পারে:
1. 1.9< A260/280< 2.1, নির্দেশ করে যে RNA বিশুদ্ধতা ভাল;A260/280<1.9, নির্দেশ করে যে RNA-তে প্রোটিনের অবশিষ্টাংশ থাকতে পারে;A260/280>2.1, RNA এর সম্ভাব্য আংশিক অবক্ষয় নির্দেশ করে, যা অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা আরও নিশ্চিত করা যেতে পারে।
2. 2.0< A260/230< 2.2, নির্দেশ করে যে RNA বিশুদ্ধতা ভাল;A260/230< 2.0, নির্দেশ করে যে RNA-তে জৈব বিকারক পদার্থের অবশিষ্টাংশ থাকতে পারে, যেমন ফেনল, ইথানল বা শর্করা।
অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস:
অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস অ্যাস RNA অখণ্ডতা, জিনোম এবং প্রোটিনের অবশিষ্টাংশ বিশ্লেষণ করতে পারে, কিন্তু RNA-এর ঘনত্ব সঠিকভাবে পরিমাপ করতে পারে না বা জৈব বিকারকগুলির অবশিষ্টাংশ সনাক্ত করতে পারে না।উদাহরণস্বরূপ ইউক্যারিওটিক আরএনএ টেমপ্লেট নিন:
1. আরএনএ অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরসিসের শিকার হয়েছিল।জেল মানচিত্রে যদি 28sRNA, 18sRNA এবং 5.8sRNA-এর শুধুমাত্র তিনটি একক ব্যান্ড থাকে, তাহলে এটি নির্দেশ করে যে নিষ্কাশিত RNA অক্ষত আছে।যদি একটি টেনে আনার ঘটনা থাকে তবে এটি আরএনএর আংশিক অবক্ষয় নির্দেশ করে।
2. যদি আঠালো গর্ত এবং 28sRNA ব্যান্ডের মধ্যে একটি একক উজ্জ্বল ব্যান্ড থাকে, তাহলে সেখানে জিনোমিক ডিএনএ অবশিষ্টাংশ থাকতে পারে।
3. যদি আঠালো গর্তে ব্যান্ডগুলি উপস্থিত হয় তবে এটি নির্দেশ করে যে প্রোটিন এবং অন্যান্য ম্যাক্রোমোলিকুলার পদার্থের অবশিষ্টাংশ থাকতে পারে।
Ⅱ. বিপরীত প্রতিলিপি
আরএনএ নিষ্কাশন সম্পন্ন হওয়ার পর, পরবর্তী পরীক্ষা-নিরীক্ষার জন্য এটিকে সিডিএনএ-তে উল্টাতে হবে, তাই রিভার্সাল ধাপ অপরিহার্য।রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ এবং প্রাইমার নির্বাচন থেকে চালু করা হবে:
বিপরীত প্রতিলিপি নির্বাচন:
সাধারণ বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেসের মধ্যে রয়েছে AMV RTase এবং MMLV RTase।AMV RTase-এর RNase H এর শক্তিশালী কার্যকলাপ, সংশ্লেষণের সংক্ষিপ্ত দৈর্ঘ্য, কম সংশ্লেষণের পরিমাণ এবং ভাল তাপীয় স্থিতিশীলতা (42 ~ 55℃) রয়েছে।MMLV RTase-এর RNase H কার্যকলাপ দুর্বল, সংশ্লেষণের দৈর্ঘ্য দীর্ঘ, সংশ্লেষণের পরিমাণ বেশি এবং তাপীয় স্থিতিশীলতা দুর্বল (37 ~ 42℃)।
যেহেতু RNase H এনজাইম RNA টেমপ্লেটকে অবনমিত করার কাজ করে, তাই দুর্বল RNase H কার্যকলাপের সাথে MMLV কে বিপরীত প্রতিলিপির সময় অগ্রাধিকারমূলকভাবে নির্বাচন করা উচিত এবং পরবর্তীতে জেনেটিক ইঞ্জিনিয়ারিংয়ের পরে, MMLV-এর তাপীয় স্থিতিশীলতা একটি গুণগত লিপে পৌঁছেছে।ফোরজিন নেওয়াForeasy Reverse Transcriptase (বিপরীত প্রতিলিপির জন্য M-MLV) উদাহরণ স্বরূপ, এটি একটি নতুন বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজ যা ই. কোলাই ইঞ্জিনিয়ারড ব্যাকটেরিয়ায় জিনগত পুনর্মিলন প্রযুক্তি ব্যবহার করে প্রকাশ করা হয়েছে।এটি একটি রিকম্বিন্যান্ট ডিএনএ পলিমারেজ যা একক-স্ট্র্যান্ডেড আরএনএ, ডিএনএ বা একটি আরএনএ:ডিএনএ হাইব্রিড থেকে একটি পরিপূরক ডিএনএ স্ট্র্যান্ডকে সংশ্লেষ করে।এটিতে কোন RNase H কার্যকলাপ, শক্তিশালী স্থিতিশীলতা, শক্তিশালী RNA সখ্যতা এবং উচ্চ সনাক্তকরণ সংবেদনশীলতা নেই।
Foreasy Reverse Transcriptase (বিপরীত প্রতিলিপির জন্য M-MLV)
প্রাইমার নির্বাচন:
সাধারণত RT প্রাইমার তিনটি বিভাগে পড়ে: অলিগো ডিটি, র্যান্ডম প্রাইমার এবং জিন-নির্দিষ্ট প্রাইমার।বিভিন্ন পরীক্ষামূলক প্রয়োজনীয়তা অনুযায়ী ব্যবহারের জন্য উপযুক্ত প্রাইমার নির্বাচন করুন।
1. যদি টেমপ্লেটটি ইউক্যারিওটিক উত্সের হয় এবং দেরীতে সিডিএনএ রুটিন পিসিআর পরিবর্ধনের জন্য ব্যবহার করা হয়, অলিগো (ডিটি) সুপারিশ করা হয়;যদি পরবর্তী পরীক্ষাটি শুধুমাত্র qPCR-এর জন্য ব্যবহার করা হয়, তাহলে বিপরীত ট্রান্সক্রিপশনের দক্ষতা উন্নত করতে অলিগো (dT) কে এলোমেলো প্রাইমারের সাথে মিশ্রিত করার পরামর্শ দেওয়া হয়।
2. যদি টেমপ্লেটটি প্রোক্যারিওট থেকে হয়, তবে র্যান্ডম প্রাইমার বা জিন নির্দিষ্ট প্রাইমারগুলিকে বিপরীত প্রতিলিপির জন্য নির্বাচন করা উচিত।
Ⅲ.qPCR
ফ্লুরোসেন্স কোয়ান্টিফিকেশন প্রধানত পরিমাণগত পদ্ধতি নির্বাচন, প্রাইমার ডিজাইন নীতি, ROX নির্বাচন, প্রতিক্রিয়া সিস্টেম কনফিগারেশন এবং প্রতিক্রিয়া শর্ত সেটিং, ইত্যাদি থেকে বিশদ করা হয়।
পরিমাণগত পদ্ধতি নির্বাচন:
পরিমাণগত পদ্ধতিগুলি আপেক্ষিক পরিমাণগত পদ্ধতি এবং পরম পরিমাণগত পদ্ধতিতে বিভক্ত।আপেক্ষিক পরিমাণ নির্ধারণ জিনের অভিব্যক্তিতে নির্দিষ্ট চিকিত্সা পদ্ধতির প্রভাব সনাক্ত করতে, বিভিন্ন সময়ে জিনের অভিব্যক্তির পার্থক্য সনাক্ত করতে এবং বিভিন্ন টিস্যুতে জিনের অভিব্যক্তির পার্থক্যের তুলনা করতে ব্যবহার করা যেতে পারে।পরম পরিমাণ নির্ণয় করতে পারে ভাইরাসে নিউক্লিক অ্যাসিডের পরিমাণ এবং তাই।পরীক্ষা-নিরীক্ষা করার সময়, আমাদের নিজেদের পরীক্ষা-নিরীক্ষা অনুযায়ী উপযুক্ত পরিমাণগত পদ্ধতি বেছে নিতে হবে।
প্রাইমার ডিজাইনের নীতিগুলি:
qPCR-এর জন্য প্রাইমারের নকশা সরাসরি পরিবর্ধন দক্ষতা এবং পণ্যের নির্দিষ্টতার সাথে সম্পর্কিত।অতএব, সঠিকভাবে ভাল প্রাইমার ডিজাইন করা সফল qPCR এর প্রথম ধাপ।প্রাইমারের ডিজাইনে, প্রচলিত প্রাইমার ডিজাইনের নীতির সাথে মিলিত হওয়ার সময় নিম্নলিখিত নীতিগুলিতে মনোযোগ দেওয়া উচিত:
1. টার্গেট ফ্র্যাগমেন্টের দৈর্ঘ্য 100 এবং 300 bp এর মধ্যে নিয়ন্ত্রিত হয়;
2. জিনোমিক ডিএনএর প্রভাব এড়াতে ক্রস-এক্সন ডিজাইন;
3. পরিবর্ধন দক্ষতার জন্য পরিকল্পিত প্রাইমারগুলি পরীক্ষা করা প্রয়োজন, এবং শুধুমাত্র যখন পরিবর্ধন কার্যকারিতা মান (90-110%) এ পৌঁছায় তখনই তারা পরিমাণগত পরীক্ষার জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে;
4. প্রাইমার ঘনত্ব সাধারণত 0.1uM এবং 1.0uM এর মধ্যে অপ্টিমাইজ করা হয়।
নির্বাচনROX:
পরিমাণগত প্রতিক্রিয়া প্রক্রিয়ায়, ROX অপটিক্যাল পথের পার্থক্য, পাইপটিং ত্রুটি বা বাষ্পীভবন এবং ঘনীভবনের কারণে আয়তনের পার্থক্য সমানভাবে সামঞ্জস্য করতে পারে, ফলাফলের পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা উন্নত করে।যাইহোক, এটি উল্লেখ করা উচিত যে ROX নির্বাচন যন্ত্রের সাথে সম্পর্কিত।যদি qPCR যন্ত্রের স্বয়ংক্রিয়ভাবে গর্তের মধ্যে পার্থক্য সংশোধন করার কাজ থাকে, তবে এটি ROX যোগ করার প্রয়োজন নেই;অন্যথায়, এটি ROX সংশোধন যোগ করতে হবে।বিকারক কেনার ক্ষেত্রে ছোট অংশীদারদের অবশ্যই সঠিক ROX বেছে নেওয়ার জন্য ব্যবহৃত যন্ত্র অনুযায়ী হতে হবে, পরবর্তীতে ভুল এড়াতে হবে।
প্রতিক্রিয়া সিস্টেমের প্রস্তুতি:
20ul এবং 50ul এর প্রতিক্রিয়া ভলিউম পছন্দ করা হয়।সিস্টেমটি তৈরি করার সময় নিম্নলিখিত বিষয়গুলিতে মনোযোগ দেওয়া উচিত:
1. অতি-পরিচ্ছন্ন ওয়ার্কবেঞ্চে বায়ুচলাচল দ্বারা প্রতিক্রিয়া ব্যবস্থা প্রস্তুত করা প্রয়োজন, নতুন ডিডিএইচ2O প্রতিটি পরীক্ষার জন্য ব্যবহৃত হয়;
2. প্রতিটি পরীক্ষায় সিস্টেমে দূষণ আছে কিনা তা যাচাই করার জন্য NTC প্রস্তুত করতে হবে এবং সিস্টেম প্রস্তুত করার সময় প্রাইমারের প্রতিটি জোড়াকে NTC করতে হবে;
3. আরএনএ টেমপ্লেটে জিডিএনএ অবশিষ্টাংশ আছে কিনা তা সনাক্ত করতে, সনাক্তকরণের জন্য প্রতিটি নমুনার জন্য এনআরটি প্রস্তুত করা যেতে পারে;
4. সিস্টেম প্রস্তুত করার সময়, একটি নমুনার জন্য কমপক্ষে 3টি প্রযুক্তিগত পুনরাবৃত্তি করার সুপারিশ করা হয়;
5. যখন টেমপ্লেটটি সিডিএনএ হয়, তখন কিউপিসিআর পরীক্ষায় বিপরীত প্রতিলিপি সিস্টেমের বাধা প্রভাব কমাতে 5-10 বার পাতলা করার পরামর্শ দেওয়া হয়।গ্রেডিয়েন্ট দ্বারা টেমপ্লেটের পরিমাণ অন্বেষণ করা ভাল, যাতে সিটি মান 20-30 এর মধ্যে পড়ে;
6. প্রয়োজনীয় সংখ্যক প্রতিক্রিয়া নির্ধারণ করুন, প্রতিক্রিয়ার সংখ্যার ভিত্তিতে 5-10% বৃদ্ধি করুন এবং ভলিউম কনফিগারেশন সংখ্যা গণনা করুন;
7, সিস্টেম প্রিমিক্স নীতি ব্যবহার করে প্রস্তুত করা হয়, সেন্ট্রিফিউগেশন পরে মিশ্রিত করা হয় এবং কোন বুদবুদ নিশ্চিত করা হয়;
8, যতদূর সম্ভব সমর্থনকারী ভোগ্যপণ্য চয়ন করুন.
সম্পর্কিত RT-qPCR কিট
কিটটি একটি অনন্য ফোরজিন রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন রিএজেন্ট এবং ফোরজিন হটস্টার টাক ডিএনএ পলিমারেজ ব্যবহার করে একটি অনন্য প্রতিক্রিয়া সিস্টেমের সাথে কার্যকরভাবে প্রতিক্রিয়ার পরিবর্ধন দক্ষতা এবং নির্দিষ্টতা উন্নত করতে।
পোস্টের সময়: এপ্রিল-২৩-২০২৩
