• পিসিআর হল একটি পদ্ধতি যা অল্প পরিমাণে ডিএনএ টেমপ্লেট থেকে ডিএনএ প্রশস্ত করতে ব্যবহৃত হয়।RT-PCR রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন ব্যবহার করে একটি RNA উৎস থেকে একটি DNA টেমপ্লেট তৈরি করে যা পরে প্রশস্ত করা যায়।
• পিসিআর এবং আরটি-পিসিআর সাধারণত এন্ডপয়েন্ট প্রতিক্রিয়া, যখন qPCR এবং RT-qPCR পিসিআর প্রতিক্রিয়ার সময় উপস্থিত টেমপ্লেটের পরিমাণ পরিমাপ করতে পণ্য সংশ্লেষণের হারের গতিবিদ্যা ব্যবহার করে।
• নতুন পদ্ধতি, যেমন ডিজিটাল পিসিআর, প্রাথমিক ডিএনএ টেমপ্লেটের নিখুঁত পরিমাপ প্রদান করে, অন্যদিকে আইসোথার্মাল পিসিআর-এর মতো পদ্ধতি নির্ভরযোগ্য ফলাফল প্রদানের জন্য ব্যয়বহুল সরঞ্জামের প্রয়োজনীয়তা হ্রাস করে।

পলিমারেজ চেইন রিঅ্যাকশন (পিসিআর) একটি তুলনামূলকভাবে সহজ এবং ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত আণবিক জীববিজ্ঞান কৌশল যা ডিএনএ এবং আরএনএ সিকোয়েন্সকে প্রশস্ত এবং সনাক্ত করতে পারে।ডিএনএ ক্লোনিং এবং প্রশস্তকরণের ঐতিহ্যগত পদ্ধতির তুলনায়, যা প্রায়শই দিন নিতে পারে, পিসিআর-এর জন্য মাত্র কয়েক ঘন্টা প্রয়োজন।পিসিআর অত্যন্ত সংবেদনশীল এবং নির্দিষ্ট ক্রম সনাক্তকরণ এবং পরিবর্ধনের জন্য ন্যূনতম টেমপ্লেট প্রয়োজন।সাধারণ ডিএনএ এবং আরএনএ সনাক্তকরণ থেকে প্রাথমিক পিসিআর পদ্ধতিগুলি আরও উন্নত হয়েছে।নীচে, আমরা আপনার গবেষণার প্রয়োজনের জন্য এনজো লাইফ সায়েন্সে বিভিন্ন পিসিআর পদ্ধতি এবং যে রিএজেন্টগুলি সরবরাহ করি তার একটি ওভারভিউ প্রদান করেছি।আমরা বিজ্ঞানীদের তাদের পরবর্তী গবেষণা প্রকল্পে PCR রিএজেন্টগুলিকে দ্রুত অ্যাক্সেস করতে সাহায্য করার লক্ষ্য রাখি!

পিসিআর

স্ট্যান্ডার্ড পিসিআর-এর জন্য, আপনার যা দরকার তা হল একটি ডিএনএ পলিমারেজ, ম্যাগনেসিয়াম, নিউক্লিওটাইডস, প্রাইমার, প্রসারিত করার জন্য ডিএনএ টেমপ্লেট এবং একটি থার্মোসাইক্লার।পিসিআর মেকানিজম তার উদ্দেশ্যের মতোই সহজ: 1) ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ (ডিএসডিএনএ) তাপ বিকৃত করা হয়, 2) প্রাইমারগুলি একক ডিএনএ স্ট্র্যান্ডের সাথে সারিবদ্ধ হয় এবং 3) প্রাইমারগুলি ডিএনএ পলিমারেজ দ্বারা প্রসারিত হয়, যার ফলে দুটি কপি হয়। মূল ডিএনএ স্ট্র্যান্ড।তাপমাত্রা এবং সময়ের একটি সিরিজে বিকৃতকরণ, অ্যানিলিং এবং প্রসারিতকরণ প্রক্রিয়াটি প্রশস্তকরণের একটি চক্র হিসাবে পরিচিত (চিত্র 1)।

চক্রের প্রতিটি ধাপ ব্যবহার করা টেমপ্লেট এবং প্রাইমার সেটের জন্য অপ্টিমাইজ করা উচিত।এই চক্রটি প্রায় 20-40 বার পুনরাবৃত্তি হয়, এবং পরিবর্ধিত পণ্যটি সাধারণত অ্যাগারোজ জেল (চিত্র 2) দ্বারা বিশ্লেষণ করা যেতে পারে।

যেহেতু পিসিআর একটি অত্যন্ত সংবেদনশীল পদ্ধতি এবং একক প্রতিক্রিয়ার জন্য খুব ছোট আয়তনের প্রয়োজন হয়, তাই বেশ কয়েকটি প্রতিক্রিয়ার জন্য একটি মাস্টার মিশ্রণ তৈরি করার পরামর্শ দেওয়া হয়।মাস্টার মিশ্রণটি অবশ্যই ভালভাবে মিশ্রিত হতে হবে এবং তারপরে বিক্রিয়ার সংখ্যা দ্বারা বিভক্ত করতে হবে, নিশ্চিত করতে হবে যে প্রতিটি বিক্রিয়াতে একই পরিমাণ এনজাইম, dNTP এবং প্রাইমার থাকবে।অনেক সরবরাহকারী, যেমন এনজো লাইফ সায়েন্স, পিসিআর মিক্সও অফার করে যাতে প্রাইমার এবং ডিএনএ টেমপ্লেট ছাড়া ইতিমধ্যেই সবকিছু থাকে।

গুয়ানাইন/সাইটোসিন-সমৃদ্ধ (জিসি-সমৃদ্ধ) অঞ্চলগুলি স্ট্যান্ডার্ড পিসিআর কৌশলগুলিতে একটি চ্যালেঞ্জ উপস্থাপন করে।GC-সমৃদ্ধ ক্রমগুলি নিম্ন GC বিষয়বস্তু সহ ক্রমগুলির তুলনায় আরও স্থিতিশীল।অধিকন্তু, GC-সমৃদ্ধ সিকোয়েন্সগুলি গৌণ কাঠামো তৈরি করে, যেমন হেয়ারপিন লুপ।ফলস্বরূপ, জিসি-সমৃদ্ধ ডাবল স্ট্র্যান্ডগুলি বিকৃতকরণ পর্যায়ে সম্পূর্ণ আলাদা করা কঠিন।ফলস্বরূপ, ডিএনএ পলিমারেজ বাধা ছাড়াই নতুন স্ট্র্যান্ডকে সংশ্লেষ করতে পারে না।একটি উচ্চতর ডিনাচুরেশন তাপমাত্রা এটিকে উন্নত করতে পারে, এবং উচ্চ অ্যানিলিং তাপমাত্রা এবং সংক্ষিপ্ত অ্যানিলিং সময়ের দিকে সামঞ্জস্য GC-সমৃদ্ধ প্রাইমারগুলির অনির্দিষ্ট বাঁধন প্রতিরোধ করতে পারে।অতিরিক্ত রিএজেন্ট GC-সমৃদ্ধ সিকোয়েন্সের পরিবর্ধনকে উন্নত করতে পারে।DMSO, গ্লিসারল, এবং betaine GC মিথস্ক্রিয়া দ্বারা সৃষ্ট গৌণ কাঠামোকে ব্যাহত করতে সাহায্য করে এবং এর ফলে ডাবল স্ট্র্যান্ডের বিচ্ছেদকে সহজতর করে।

হট স্টার্ট পিসিআর

অনির্দিষ্ট পরিবর্ধন একটি সমস্যা যা PCR সময় ঘটতে পারে।পিসিআর-এর জন্য ব্যবহৃত বেশিরভাগ ডিএনএ পলিমারেজ 68°C থেকে 72°C তাপমাত্রায় সবচেয়ে ভালো কাজ করে।এনজাইম, তবে, কম তাপমাত্রায়ও সক্রিয় হতে পারে, যদিও কম মাত্রায়।অ্যানিলিং তাপমাত্রার অনেক নীচে তাপমাত্রায়, প্রাইমারগুলি অ-নির্দিষ্টভাবে আবদ্ধ হতে পারে এবং অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনের দিকে পরিচালিত করতে পারে, এমনকি প্রতিক্রিয়াটি বরফের উপর স্থাপন করা হলেও।পলিমারেজ ইনহিবিটর ব্যবহার করে এটি প্রতিরোধ করা যেতে পারে যেগুলি শুধুমাত্র একটি নির্দিষ্ট তাপমাত্রায় পৌঁছানোর পরে ডিএনএ পলিমারেজ থেকে বিচ্ছিন্ন হয়ে যায়, তাই হট স্টার্ট পিসিআর শব্দটি।ইনহিবিটার একটি অ্যান্টিবডি হতে পারে যা পলিমারেজ এবং ডেনেচারকে প্রাথমিক বিকৃতকরণ তাপমাত্রায় (সাধারণত 95°C) আবদ্ধ করে।

উচ্চ বিশ্বস্ততা পলিমারেজ

যদিও ডিএনএ পলিমারেজগুলি মূল টেমপ্লেট ক্রম অনুসারে মোটামুটি সঠিকভাবে প্রসারিত করে, নিউক্লিওটাইড মিলের ক্ষেত্রে ভুল হতে পারে।ক্লোনিংয়ের মতো অ্যাপ্লিকেশনে অমিলের ফলে ট্রাঙ্কটেড ট্রান্সক্রিপ্ট এবং ভুল অনুবাদ বা নিষ্ক্রিয় প্রোটিন ডাউনস্ট্রিম হতে পারে।এই অমিলগুলি এড়াতে, একটি "প্রুফরিডিং" কার্যকলাপ সহ পলিমারেজগুলি চিহ্নিত করা হয়েছে এবং কর্মপ্রবাহের মধ্যে অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছে।প্রথম প্রুফরিডিং পলিমারেজ, Pfu, 1991 সালে Pyrococcus furiosus-এ সনাক্ত করা হয়েছিল।এই Pfu এনজাইমের একটি 3' থেকে 5' exonuclease কার্যকলাপ রয়েছে।ডিএনএ প্রসারিত হওয়ার সাথে সাথে, এক্সোনিউক্লিজ স্ট্র্যান্ডের 3' প্রান্তে অমিল নিউক্লিওটাইডগুলি সরিয়ে দেয়।সঠিক নিউক্লিওটাইড তারপর প্রতিস্থাপিত হয়, এবং ডিএনএ সংশ্লেষণ চলতে থাকে।ভুল নিউক্লিওটাইড সিকোয়েন্সের সনাক্তকরণ এনজাইমের সাথে সঠিক নিউক্লিওসাইড ট্রাইফসফেটের বাঁধাইয়ের উপর ভিত্তি করে, যেখানে অদক্ষ বাঁধাই সংশ্লেষণকে ধীর করে দেয় এবং সঠিক প্রতিস্থাপনের অনুমতি দেয়।Pfu পলিমারেজের প্রুফরিডিং কার্যকলাপের ফলে Taq DNA পলিমারেজের তুলনায় চূড়ান্ত অনুক্রমে কম ত্রুটি দেখা দেয়।সাম্প্রতিক বছরগুলিতে, অন্যান্য প্রুফরিডিং এনজাইমগুলি চিহ্নিত করা হয়েছে, এবং ডিএনএ পরিবর্ধনের সময় ত্রুটির হার আরও কমাতে মূল Pfu এনজাইমের পরিবর্তন করা হয়েছে।

আরটি-পিসিআর

বিপরীত প্রতিলিপি PCR, বা RT-PCR, একটি টেমপ্লেট হিসাবে RNA ব্যবহার করার অনুমতি দেয়।একটি অতিরিক্ত পদক্ষেপ RNA সনাক্তকরণ এবং পরিবর্ধনের অনুমতি দেয়।আরএনএ বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজ ব্যবহার করে পরিপূরক ডিএনএ (সিডিএনএ) তে বিপরীত প্রতিলিপি করা হয়।আরএনএ টেমপ্লেটের গুণমান এবং বিশুদ্ধতা RT-PCR-এর সাফল্যের জন্য অপরিহার্য।RT-PCR-এর প্রথম ধাপ হল একটি DNA/RNA হাইব্রিডের সংশ্লেষণ।বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজের একটি RNase H ফাংশনও রয়েছে, যা হাইব্রিডের RNA অংশকে হ্রাস করে।সিডিএনএ-তে বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজের ডিএনএ-নির্ভর ডিএনএ পলিমারেজ কার্যকলাপের মাধ্যমে একক-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ অণু সম্পূর্ণ হয়।প্রথম-স্ট্র্যান্ড প্রতিক্রিয়ার কার্যকারিতা পরিবর্ধন প্রক্রিয়াকে প্রভাবিত করতে পারে।এখান থেকে, সিডিএনএ প্রশস্ত করতে স্ট্যান্ডার্ড পিসিআর পদ্ধতি ব্যবহার করা হয়।RT-PCR দ্বারা RNA-কে cDNA-তে প্রত্যাবর্তন করার সম্ভাবনার অনেক সুবিধা রয়েছে এবং এটি প্রাথমিকভাবে জিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহৃত হয়।আরএনএ একক-স্ট্রেন্ডেড এবং খুব অস্থির, যা এটির সাথে কাজ করা চ্যালেঞ্জিং করে তোলে।এটি সাধারণত qPCR-তে প্রথম ধাপ হিসেবে কাজ করে, যা একটি জৈবিক নমুনায় RNA ট্রান্সক্রিপ্টের পরিমাণ নির্ধারণ করে।

qPCR এবং RT-qPCR

পরিমাণগত পিসিআর (qPCR) অসংখ্য অ্যাপ্লিকেশনের জন্য নিউক্লিক অ্যাসিড সনাক্ত করতে, চিহ্নিত করতে এবং পরিমাণ নির্ধারণ করতে ব্যবহৃত হয়।RT-qPCR-এ, RNA ট্রান্সক্রিপ্টগুলিকে প্রায়শই উপরে বর্ণিত হিসাবে প্রথমে cDNA-তে বিপরীত প্রতিলিপি করে পরিমাপ করা হয় এবং তারপরে qPCR পরবর্তীতে করা হয়।স্ট্যান্ডার্ড পিসিআর-এর মতো, ডিএনএ তিনটি পুনরাবৃত্তিমূলক ধাপ দ্বারা প্রসারিত হয়: বিকৃতকরণ, অ্যানিলিং এবং প্রসারণ।যাইহোক, কিউপিসিআর-এ, ফ্লুরোসেন্ট লেবেলিং পিসিআর অগ্রগতির সাথে সাথে ডেটা সংগ্রহ করতে সক্ষম করে।উপলব্ধ পদ্ধতি এবং রসায়নের পরিসরের কারণে এই কৌশলটির অনেক সুবিধা রয়েছে।

ডাই-ভিত্তিক qPCR (সাধারণত সবুজ), ফ্লুরোসেন্ট লেবেলিং একটি dsDNA বাইন্ডিং ডাই ব্যবহার করে পরিবর্ধিত ডিএনএ অণুগুলির পরিমাণ নির্ধারণের অনুমতি দেয়।প্রতিটি চক্রের সময়, ফ্লুরোসেন্স পরিমাপ করা হয়।ফ্লুরোসেন্স সংকেত প্রতিলিপিকৃত ডিএনএর পরিমাণের সমানুপাতিকভাবে বৃদ্ধি পায়।তাই, ডিএনএ "রিয়েল-টাইমে" (চিত্র 3) পরিমাপ করা হয়।ডাই-ভিত্তিক qPCR-এর অসুবিধাগুলি হল যে একবারে শুধুমাত্র একটি লক্ষ্য পরীক্ষা করা যেতে পারে এবং রঞ্জকটি নমুনায় উপস্থিত যেকোনো ds-DNA এর সাথে আবদ্ধ হবে।

প্রোব-ভিত্তিক qPCR-তে, প্রতিটি নমুনায় একসাথে অনেকগুলি লক্ষ্য সনাক্ত করা যেতে পারে, তবে এর জন্য প্রাইমার ছাড়াও ব্যবহৃত লক্ষ্য-নির্দিষ্ট প্রোবের অপ্টিমাইজেশন এবং ডিজাইন প্রয়োজন।বিভিন্ন ধরণের প্রোব ডিজাইন পাওয়া যায়, তবে সবচেয়ে সাধারণ ধরনটি হল একটি হাইড্রোলাইসিস প্রোব, যা একটি ফ্লুরোফোর এবং quencher অন্তর্ভুক্ত করে।ফ্লুরোসেন্স রেজোন্যান্স এনার্জি ট্রান্সফার (FRET) প্রোবটি অক্ষত থাকাকালীন quencher এর মাধ্যমে ফ্লুরোফোরের নির্গমনকে বাধা দেয়।যাইহোক, পিসিআর প্রতিক্রিয়ার সময়, প্রাইমার এক্সটেনশনের সময় প্রোবটি হাইড্রোলাইজ করা হয় এবং নির্দিষ্ট অনুক্রমের পরিবর্ধন করা হয় যা এটি আবদ্ধ।প্রোবের ক্লিভেজ ফ্লুরোফোরকে quencher থেকে আলাদা করে এবং এর ফলে ফ্লুরোসেন্সের পরিবর্ধন-নির্ভর বৃদ্ধি ঘটে (চিত্র 4)।সুতরাং, একটি প্রোব-ভিত্তিক qPCR প্রতিক্রিয়া থেকে ফ্লুরোসেন্স সংকেত নমুনায় উপস্থিত প্রোবের লক্ষ্য ক্রমের পরিমাণের সমানুপাতিক।যেহেতু প্রোব-ভিত্তিক qPCR ডাই-ভিত্তিক qPCR এর চেয়ে বেশি নির্দিষ্ট, এটি প্রায়শই qPCR-ভিত্তিক ডায়াগনস্টিক অ্যাসে ব্যবহৃত প্রযুক্তি।

আইসোথার্মাল অ্যামপ্লিফিকেশন

উপরে উল্লিখিত পিসিআর কৌশলগুলির জন্য দামী থার্মোসাইক্লিং সরঞ্জামের প্রয়োজন হয় যাতে চেম্বারের তাপমাত্রা সঠিকভাবে ডিনাচুরেশন, অ্যানিলিং, এবং এক্সটেনশন ধাপে র‌্যাম্প করা যায়।বেশ কয়েকটি কৌশল তৈরি করা হয়েছে যেগুলির জন্য এই জাতীয় সুনির্দিষ্ট ডিভাইসের প্রয়োজন নেই এবং এটি একটি সাধারণ জল স্নানে বা এমনকি আগ্রহের কোষগুলির মধ্যেও সঞ্চালিত হতে পারে।এই কৌশলগুলিকে সমষ্টিগতভাবে আইসোথার্মাল অ্যামপ্লিফিকেশন বলা হয় এবং সূচকীয়, রৈখিক বা ক্যাসকেড পরিবর্ধনের উপর ভিত্তি করে কাজ করে।

আইসোথার্মাল অ্যামপ্লিফিকেশনের সবচেয়ে পরিচিত ধরন হল লুপ-মিডিয়াটেড আইসোথার্মাল অ্যামপ্লিফিকেশন বা এলএএমপি।LAMP টেমপ্লেট DNA বা RNA প্রশস্ত করতে 65⁰C এ সূচকীয় পরিবর্ধন ব্যবহার করে।LAMP সম্পাদন করার সময়, লক্ষ্য ডিএনএর অঞ্চলের পরিপূরক চার থেকে ছয়টি প্রাইমার নতুন ডিএনএ সংশ্লেষণের জন্য একটি ডিএনএ পলিমারেজের সাথে ব্যবহার করা হয়।এই প্রাইমারগুলির মধ্যে দুটিতে প্রশংসাসূচক ক্রম রয়েছে যা অন্যান্য প্রাইমারের ক্রমগুলিকে চিনতে পারে এবং তাদের আবদ্ধ করে, নতুন সংশ্লেষিত ডিএনএ-তে একটি "লুপ" গঠন তৈরি করতে দেয় যা পরবর্তী রাউন্ডের পরিবর্ধনে প্রাইমার অ্যানিলিংয়ে সহায়তা করে।LAMP ফ্লুরোসেন্স, অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস বা কালোরিমেট্রি সহ একাধিক পদ্ধতি দ্বারা কল্পনা করা যেতে পারে।কালোরিমেট্রির মাধ্যমে পণ্যের উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিকে দৃশ্যমান এবং সনাক্ত করার সহজতা এবং প্রয়োজনীয় ব্যয়বহুল সরঞ্জামের অভাব LAMP-কে SARS-CoV-2 পরীক্ষার জন্য উপযুক্ত বিকল্প করে তুলেছে যেখানে ক্লিনিকাল ল্যাব টেস্টিং সহজলভ্য ছিল না, বা নমুনা সংরক্ষণ এবং পরিবহন। সম্ভব ছিল না, বা ল্যাবগুলিতে যেগুলিতে আগে পিসিআর থার্মোসাইক্লিং সরঞ্জাম ছিল না।