শুরু উপাদান: RNA

কোয়ান্টিটেটিভ রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন পিসিআর (আরটি-কিউপিসিআর) হল একটি পরীক্ষামূলক পদ্ধতি যা পিসিআর পরীক্ষায় ব্যবহৃত হয় আরএনএকে প্রারম্ভিক উপাদান হিসাবে ব্যবহার করে।এই পদ্ধতিতে, মোট RNA বা মেসেঞ্জার RNA (mRNA) প্রথমে বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজ দ্বারা পরিপূরক DNA (cDNA) তে প্রতিলিপি করা হয়।পরবর্তীকালে, একটি টেমপ্লেট হিসাবে সিডিএনএ ব্যবহার করে একটি কিউপিসিআর প্রতিক্রিয়া সঞ্চালিত হয়েছিল।RT-qPCR জিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ, আরএনএ হস্তক্ষেপের বৈধতা, মাইক্রোয়ারে বৈধতা, প্যাথোজেন সনাক্তকরণ, জেনেটিক পরীক্ষা এবং রোগ গবেষণা সহ বিভিন্ন আণবিক জীববিজ্ঞান অ্যাপ্লিকেশনে ব্যবহার করা হয়েছে।

RT-qPCR-এর জন্য এক-পদক্ষেপ এবং দুই-পদক্ষেপ পদ্ধতি

RT-qPCR একটি এক-পদক্ষেপ বা দুই-পদক্ষেপ পদ্ধতি দ্বারা সম্পন্ন করা যেতে পারে।ওয়ান-স্টেপ RT-qPCR রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন এবং পিসিআর অ্যামপ্লিফিকেশনকে একত্রিত করে, রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ এবং ডিএনএ পলিমারেজকে একই বাফার অবস্থার অধীনে একই টিউবে প্রতিক্রিয়া সম্পূর্ণ করতে দেয়।এক-ধাপে RT-qPCR-এর জন্য শুধুমাত্র ক্রম-নির্দিষ্ট প্রাইমার ব্যবহার করা প্রয়োজন।দ্বি-পদক্ষেপ RT-qPCR-এ, বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন এবং পিসিআর পরিবর্ধন দুটি টিউবে সঞ্চালিত হয়, বিভিন্ন অপ্টিমাইজড বাফার, প্রতিক্রিয়া অবস্থা এবং প্রাইমার ডিজাইন কৌশল ব্যবহার করে।

নিবন্ধ 1

 

সুবিধা

অসুবিধা

একধাপ এই পদ্ধতিতে কম পরীক্ষামূলক ত্রুটি রয়েছে কারণ উভয় প্রতিক্রিয়া একটি টিউবে সম্পন্ন হয়

 

কম পাইপিং পদক্ষেপ দূষণের ঝুঁকি কমায়

 

উচ্চ-থ্রুপুট পরিবর্ধন/স্ক্রিনিংয়ের জন্য উপযুক্ত, দ্রুত এবং পুনরুত্পাদনযোগ্য

দ্বি-পদক্ষেপ প্রতিক্রিয়া আলাদাভাবে অপ্টিমাইজ করা যাবে না

 

যেহেতু প্রতিক্রিয়ার শর্তগুলি দ্বি-পদক্ষেপের প্রতিক্রিয়াকে একত্রিত করে আপস করা হয়, তাই সংবেদনশীলতা দ্বি-পদক্ষেপ পদ্ধতির মতো ভাল নয়।

 

একটি একক নমুনা দ্বারা সনাক্ত করা লক্ষ্যের সংখ্যা কম

দুই ধাপ স্থিতিশীল সিডিএনএ লাইব্রেরি তৈরি করার ক্ষমতা যা দীর্ঘ সময়ের জন্য সংরক্ষণ করা যায় এবং একাধিক প্রতিক্রিয়ায় ব্যবহার করা যায়

 

একাধিক সিডিএনএ লাইব্রেরির প্রয়োজন ছাড়াই একই সিডিএনএ লাইব্রেরি থেকে টার্গেট জিন এবং রেফারেন্স জিনগুলিকে বিবর্ধিত করা যেতে পারে

 

প্রতিক্রিয়া বাফার এবং প্রতিক্রিয়া শর্ত যা একক প্রতিক্রিয়া রানের অপ্টিমাইজেশন সক্ষম করে

 

ট্রিগার অবস্থার নমনীয় নির্বাচন

একাধিক টিউব ব্যবহার করা, এবং আরো পাইপিং ধাপ ডিএনএ দূষণের ঝুঁকি বাড়ায়,

এবং সময় গ্রাসকারী।

 

এক-পদক্ষেপ পদ্ধতির চেয়ে বেশি অপ্টিমাইজেশান প্রয়োজন

সংশ্লিষ্ট পণ্য:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (এক ধাপ)-SYBR Green I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (এক ধাপ)-তাকমান

ফার্স্ট-স্ট্র্যান্ড সিডিএনএ সংশ্লেষণের জন্য RT Easyᴹ I মাস্টার প্রিমিক্স

রিয়েল টাইম PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I কিট

রিয়েল টাইম PCR Easyᵀᴹ-Takman

মোট RNA এবং mRNA নির্বাচন

একটি RT-qPCR পরীক্ষা ডিজাইন করার সময়, বিপরীত প্রতিলিপির জন্য একটি টেমপ্লেট হিসাবে মোট RNA বা বিশুদ্ধ mRNA ব্যবহার করবেন কিনা তা সিদ্ধান্ত নেওয়া গুরুত্বপূর্ণ।যদিও mRNA সামান্য উচ্চ সংবেদনশীলতা প্রদান করতে সক্ষম হতে পারে, মোট RNA এখনও প্রায়শই ব্যবহৃত হয়।এর কারণ হল যে মোট RNA-এর mRNA-এর তুলনায় প্রারম্ভিক উপাদান হিসাবে আরও গুরুত্বপূর্ণ সুবিধা রয়েছে।প্রথমত, প্রক্রিয়াটির জন্য কম পরিশোধন পদক্ষেপের প্রয়োজন, যা টেমপ্লেটের ভাল পরিমাণগত পুনরুদ্ধার এবং সেল নম্বর শুরু করার ফলাফলের আরও ভাল স্বাভাবিককরণ নিশ্চিত করে।দ্বিতীয়ত, এটি এমআরএনএ সমৃদ্ধকরণ পদক্ষেপ এড়িয়ে যায়, যা বিভিন্ন এমআরএনএ-এর বিভিন্ন পুনরুদ্ধারের কারণে তির্যক ফলাফলের সম্ভাবনা এড়াতে পারে।সামগ্রিকভাবে, যেহেতু বেশিরভাগ অ্যাপ্লিকেশনে লক্ষ্য জিনের আপেক্ষিক পরিমাণ সনাক্তকরণের পরম সংবেদনশীলতার চেয়ে বেশি গুরুত্বপূর্ণ, মোট আরএনএ বেশিরভাগ ক্ষেত্রেই বেশি উপযুক্ত।

বিপরীত প্রতিলিপি প্রাইমার

দ্বি-পদক্ষেপ পদ্ধতিতে, তিনটি ভিন্ন পদ্ধতি ব্যবহার করা যেতে পারে সিডিএনএ বিক্রিয়াকে প্রাইম করার জন্য: অলিগো(ডিটি) প্রাইমার, এলোমেলো প্রাইমার, বা সিকোয়েন্স-নির্দিষ্ট প্রাইমার।সাধারণত, অলিগো(ডিটি) প্রাইমার এবং এলোমেলো প্রাইমারগুলি সংমিশ্রণে ব্যবহৃত হয়।এই প্রাইমারগুলি টেমপ্লেট mRNA স্ট্র্যান্ডের সাথে অ্যানিল করে এবং সংশ্লেষণের জন্য একটি সূচনা বিন্দু সহ বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজ প্রদান করে।

নিবন্ধ 2

প্রাইমার নির্বাচন গঠন এবং ফাংশন সুবিধা অসুবিধা
অলিগো(ডিটি) প্রাইমার (বা অ্যাঙ্করড অলিগো(ডিটি) প্রাইমার) mRNA এর পলি(A) লেজে থাইমিনের অবশিষ্টাংশে বর্ধিত অ্যানিলিং;অ্যাঙ্কর অলিগো(ডিটি) প্রাইমারে 3′ শেষে একটি G, C বা A থাকে (অ্যাঙ্কর সাইট) পলি(A)-টেইলড mRNA থেকে পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের cDNA এর সংশ্লেষণ

 

কম প্রারম্ভিক উপাদান উপলব্ধ হলে প্রযোজ্য

 

অ্যাঙ্করিং সাইট নিশ্চিত করে যে অলিগো(ডিটি) প্রাইমার mRNA এর 5′ পলি(A) লেজের সাথে আবদ্ধ হয়

শুধুমাত্র পলি(A) লেজের সাথে জিনকে প্রশস্ত করার জন্য উপযুক্ত

 

পলি(A) তে প্রাইমিং সাইট*2 থেকে কাটা cDNA প্রাপ্ত করুন

 

3′ প্রান্তে আবদ্ধ হতে পক্ষপাতিত্ব*

 

*অ্যাঙ্কর করা অলিগো(ডিটি) প্রাইমার ব্যবহার করা হলে এই সম্ভাবনা কম হয়

র্যান্ডম প্রাইমার

 

দৈর্ঘ্যে 6 থেকে 9 ঘাঁটি, যা RNA ট্রান্সক্রিপশনের সময় একাধিক সাইটে অ্যানিল করতে পারে সমস্ত আরএনএ (tRNA, rRNA, এবং mRNA) এর সাথে সংযুক্ত করুন

 

উল্লেখযোগ্য সেকেন্ডারি স্ট্রাকচার সহ ট্রান্সক্রিপ্টের জন্য উপযুক্ত, বা কম প্রারম্ভিক উপাদান পাওয়া গেলে

 

উচ্চ সিডিএনএ ফলন

সিডিএনএ সমস্ত আরএনএ থেকে বিপরীত প্রতিলিপি করা হয়, যা সাধারণত কাঙ্ক্ষিত হয় না এবং লক্ষ্য এমআরএনএর সংকেতকে পাতলা করতে পারে

 

সিডিএনএ কাটা

ক্রম-নির্দিষ্ট প্রাইমার নির্দিষ্ট mRNA ক্রম লক্ষ্য করে কাস্টম প্রাইমার নির্দিষ্ট cDNA লাইব্রেরি

 

সংবেদনশীলতা উন্নত করুন

 

বিপরীত qPCR প্রাইমার ব্যবহার করে

শুধুমাত্র একটি টার্গেট জিনের সংশ্লেষণে সীমাবদ্ধ

বিপরীত প্রতিলিপি

রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ হল একটি এনজাইম যা ডিএনএ সংশ্লেষণ করতে আরএনএ ব্যবহার করে।কিছু বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেসে RNase কার্যকলাপ থাকে এবং ট্রান্সক্রিপশনের পরে RNA-DNA হাইব্রিড স্ট্র্যান্ডে RNA স্ট্র্যান্ডকে অবনমিত করতে পারে।যদি এটিতে RNase এনজাইমেটিক কার্যকলাপ না থাকে তবে উচ্চতর qPCR দক্ষতার জন্য RNaseH যোগ করা যেতে পারে।সাধারণত ব্যবহৃত এনজাইমের মধ্যে রয়েছে মোলোনি মুরিন লিউকেমিয়া ভাইরাস রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ এবং এভিয়ান মাইলোব্লাস্টোমা ভাইরাস রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ।RT-qPCR-এর জন্য, উচ্চতর থার্মোস্ট্যাবিলিটি সহ একটি বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজ বেছে নেওয়া আদর্শ, যাতে উচ্চতর তাপমাত্রায় সিডিএনএ সংশ্লেষণ করা যায়, উচ্চ মাধ্যমিক কাঠামোর সাথে RNA-এর সফল ট্রান্সক্রিপশন নিশ্চিত করে, প্রতিক্রিয়া জুড়ে তাদের সম্পূর্ণ কার্যকলাপ বজায় রেখে, ফলে উচ্চতর তাপমাত্রায় সিডিএনএ ফলন।

সংশ্লিষ্ট পণ্য:

Foreasy M-MLV রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ

রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজের RNase H কার্যকলাপ

RNaseH আরএনএ-ডিএনএ ডুপ্লেক্স থেকে আরএনএ স্ট্র্যান্ডগুলিকে অবনমিত করতে সক্ষম, ডবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএর দক্ষ সংশ্লেষণের অনুমতি দেয়।যাইহোক, লম্বা mRNA কে টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহার করার সময়, RNA অকালে ক্ষয় হতে পারে, ফলে cDNA কেটে যায়।তাই, দীর্ঘ ট্রান্সক্রিপ্টের সংশ্লেষণ চাইলে সিডিএনএ ক্লোনিংয়ের সময় RNaseH কার্যকলাপ কমিয়ে আনা প্রায়ই উপকারী।বিপরীতে, RNase H কার্যকলাপের সাথে বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজগুলি প্রায়শই qPCR অ্যাপ্লিকেশনের জন্য উপকারী কারণ তারা PCR-এর প্রথম চক্রের সময় RNA-DNA ডুপ্লেক্সের গলন বাড়ায়।

প্রাইমার ডিজাইন

RT-qPCR-এ qPCR ধাপের জন্য ব্যবহৃত PCR প্রাইমারগুলিকে আদর্শভাবে একটি এক্সন-এক্সন জংশন বিস্তৃত করার জন্য ডিজাইন করা উচিত, যেখানে একটি পরিবর্ধন প্রাইমার সম্ভাব্যভাবে একটি প্রকৃত এক্সন-ইন্ট্রন সীমানা জুড়ে দিতে পারে।যেহেতু ইন্ট্রন-ধারণকারী জিনোমিক ডিএনএ সিকোয়েন্সগুলিকে বিবর্ধিত করা হয় না, তাই এই নকশাটি জিনোমিক ডিএনএকে দূষিত করার থেকে মিথ্যা ইতিবাচক প্রসারিত হওয়ার ঝুঁকি হ্রাস করে।

যদি প্রাইমারগুলিকে এক্সন বা এক্সন-এক্সন সীমানা আলাদা করার জন্য ডিজাইন করা না যায়, তাহলে জিনোমিক ডিএনএ দূষণ অপসারণের জন্য RNase-মুক্ত DNase I বা dsDNase দিয়ে RNA নমুনাগুলিকে চিকিত্সা করা প্রয়োজন হতে পারে।

RT-qPCR নিয়ন্ত্রণ

একটি বিপরীত প্রতিলিপি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ (-RT নিয়ন্ত্রণ) DNA দূষণ (যেমন পূর্ববর্তী প্রতিক্রিয়া থেকে জিনোমিক DNA বা PCR পণ্য) সনাক্ত করতে সমস্ত RT-qPCR পরীক্ষায় অন্তর্ভুক্ত করা উচিত।এই নিয়ন্ত্রণে বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেস ছাড়া সমস্ত প্রতিক্রিয়া উপাদান রয়েছে।যেহেতু এই নিয়ন্ত্রণের সাথে বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন ঘটে না, যদি পিসিআর পরিবর্ধন পরিলক্ষিত হয় তবে ডিএনএ থেকে দূষণের সম্ভাবনা সবচেয়ে বেশি।


পোস্টের সময়: আগস্ট-০২-২০২২