1. মৌলিক জ্ঞান (যদি আপনি পরীক্ষামূলক অংশ দেখতে চান, অনুগ্রহ করে সরাসরি দ্বিতীয় অংশে স্থানান্তর করুন)

প্রচলিত পিসিআর-এর ডেরিভেটিভ প্রতিক্রিয়া হিসাবে, রিয়েল টাইম পিসিআর প্রধানত ফ্লুরোসেন্স সিগন্যালের পরিবর্তনের মাধ্যমে পিসিআর অ্যামপ্লিফিকেশন প্রতিক্রিয়ার প্রতিটি চক্রে পরিবর্ধন পণ্যের পরিমাণের পরিবর্তনের উপর নজর রাখে এবং ct মান এবং স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখার মধ্যে সম্পর্কের মাধ্যমে প্রারম্ভিক টেমপ্লেটটি পরিমাণগতভাবে বিশ্লেষণ করে।

আরটি-পিসিআর-এর নির্দিষ্ট ডেটা হলভিত্তিরেখা, ফ্লুরোসেন্স থ্রেশহোল্ডএবংCt মান।

RT-PCR-এর জন্য সাধারণ লেবেল পদ্ধতি:

2. পরীক্ষামূলক পদক্ষেপ

2.1 পরীক্ষামূলক গ্রুপিং সম্পর্কে- গ্রুপে একাধিক কূপ থাকতে হবে এবং জৈবিক পুনরাবৃত্তি থাকতে হবে।

2.2 প্রাইমার ডিজাইনের নীতি

①SiRNA প্রজাতি-নির্দিষ্ট, এবং বিভিন্ন প্রজাতির ক্রম ভিন্ন হবে।

②SiRNA ফ্রিজ-শুকনো পাউডারে প্যাকেজ করা হয়, যা ঘরের তাপমাত্রায় 2-4 সপ্তাহের জন্য স্থিরভাবে সংরক্ষণ করা যেতে পারে।

2.3 সরঞ্জাম বা বিকারক যা আগে থেকে প্রস্তুত করা প্রয়োজন

2.4 নির্দিষ্ট পরীক্ষামূলক পদক্ষেপগুলিতে যে বিষয়গুলিতে মনোযোগ দেওয়া দরকার সেগুলি সম্পর্কে:

①siRNA স্থানান্তর প্রক্রিয়া

1. কলাইয়ের জন্য, আপনি 24-ওয়েল প্লেট, 12-ওয়েল প্লেট বা 6-ওয়েল প্লেট বেছে নিতে পারেন (24-ওয়েল প্লেটের প্রতিটি কূপে প্রস্তাবিত গড় RNA ঘনত্ব প্রায় 100-300 ng/uL), এবং কোষের সর্বোত্তম স্থানান্তর ঘনত্ব 60% -80% পর্যন্ত

2. স্থানান্তর পদক্ষেপ এবং নির্দিষ্ট প্রয়োজনীয়তা কঠোরভাবে নির্দেশাবলী অনুযায়ী হয়.

3. স্থানান্তরের পরে, mRNA সনাক্তকরণ (RT-PCR) বা 48-96 ঘন্টার মধ্যে প্রোটিন সনাক্তকরণের জন্য 24-72 ঘন্টার মধ্যে নমুনা সংগ্রহ করা যেতে পারে (WB)

② RNA নিষ্কাশন প্রক্রিয়া

1. বহিরাগত এনজাইম দ্বারা দূষণ প্রতিরোধ করুন।এটি প্রধানত কঠোরভাবে মুখোশ এবং গ্লাভস পরা অন্তর্ভুক্ত;জীবাণুমুক্ত পাইপেট টিপস এবং ইপি টিউব ব্যবহার করে;পরীক্ষায় ব্যবহৃত জল অবশ্যই RNase-মুক্ত হতে হবে।

2. দ্রুত নিষ্কাশন কিটে প্রস্তাবিত হিসাবে এটি দ্বিগুণ করার সুপারিশ করা হয়, যা সত্যিই বিশুদ্ধতা এবং ফলন উন্নত করবে।

3. বর্জ্য তরল অবশ্যই আরএনএ কলাম স্পর্শ করবে না।

③ RNA পরিমাপ

আরএনএ বের করার পর, এটি সরাসরি Nanodrop দিয়ে পরিমাপ করা যেতে পারে, এবং সর্বনিম্ন রিডিং 10ng/ul-এর মতো কম হতে পারে।

④বিপরীত প্রতিলিপি প্রক্রিয়া

1. RT-qPCR-এর উচ্চ সংবেদনশীলতার কারণে, প্রতিটি নমুনার জন্য কমপক্ষে 3টি সমান্তরাল কূপ তৈরি করা উচিত যাতে পরবর্তী Ct খুব বেশি আলাদা না হয় বা পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণের জন্য SDটি খুব বড় না হয়।

2. মাস্টার মিক্স বারবার জমে ও গলাবেন না।

3. প্রতিটি টিউব/গর্ত অবশ্যই একটি নতুন টিপ দিয়ে প্রতিস্থাপন করতে হবে!নমুনা যোগ করার জন্য ক্রমাগত একই পাইপেট টিপ ব্যবহার করবেন না!

4. নমুনা যোগ করার পরে 96-ওয়েল প্লেটের সাথে সংযুক্ত ফিল্মটিকে একটি প্লেট দিয়ে মসৃণ করা দরকার।এটি মেশিনে রাখার আগে সেন্ট্রিফিউজ করা ভাল, যাতে টিউবের দেওয়ালে তরলটি নীচে প্রবাহিত হতে পারে এবং বায়ু বুদবুদগুলি অপসারণ করতে পারে।

⑤সাধারণ বক্ররেখা বিশ্লেষণ

2.5 তথ্য বিশ্লেষণ সম্পর্কে

কিউপিসিআর-এর ডেটা বিশ্লেষণকে আপেক্ষিক পরিমাণ এবং পরম পরিমাণে ভাগ করা যেতে পারে।উদাহরণস্বরূপ, কন্ট্রোল গ্রুপের কোষগুলির সাথে তুলনা করে চিকিত্সা গ্রুপের কোষগুলি,

X জিনের mRNA কতবার পরিবর্তিত হয়, এটি আপেক্ষিক পরিমাপ;নির্দিষ্ট সংখ্যক কোষে, X জিনের mRNA

কত কপি আছে, এটি পরম পরিমাণ।সাধারণত আমরা ল্যাবরেটরিতে যা ব্যবহার করি তা হল আপেক্ষিক পরিমাণগত পদ্ধতি।সাধারণত,2-ΔΔct পদ্ধতিপরীক্ষায় সবচেয়ে বেশি ব্যবহৃত হয়, তাই শুধুমাত্র এই পদ্ধতিটি এখানে বিস্তারিতভাবে চালু করা হবে।

2-ΔΔct পদ্ধতি: প্রাপ্ত ফলাফল হ'ল কন্ট্রোল গ্রুপের লক্ষ্য জিনের তুলনায় পরীক্ষামূলক গ্রুপে লক্ষ্য জিনের অভিব্যক্তিতে পার্থক্য।লক্ষ্য জিন এবং অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিন উভয়ের পরিবর্ধন কার্যকারিতা 100% এর কাছাকাছি হওয়া প্রয়োজন এবং আপেক্ষিক বিচ্যুতি 5% এর বেশি হওয়া উচিত নয়।

গণনা পদ্ধতি নিম্নরূপ:

Δct কন্ট্রোল গ্রুপ = কন্ট্রোল গ্রুপে টার্গেট জিনের ct মান - কন্ট্রোল গ্রুপে অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিনের ct মান

Δct পরীক্ষামূলক গ্রুপ = পরীক্ষামূলক গ্রুপে লক্ষ্য জিনের ct মান - পরীক্ষামূলক গ্রুপে অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিনের ct মান

ΔΔct=Δct পরীক্ষামূলক গ্রুপ-Δct নিয়ন্ত্রণ গ্রুপ

অবশেষে, অভিব্যক্তি স্তরের পার্থক্যের একাধিক গণনা করুন:

ভাঁজ পরিবর্তন করুন = 2-ΔΔct (এক্সেল ফাংশনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ হল POWER)

সংশ্লিষ্ট পণ্য:

সেল ডাইরেক্ট RT-qPCR কিট