1. মৌলিক জ্ঞান (যদি আপনি পরীক্ষামূলক অংশ দেখতে চান, অনুগ্রহ করে সরাসরি দ্বিতীয় অংশে স্থানান্তর করুন)
প্রচলিত পিসিআর-এর ডেরিভেটিভ প্রতিক্রিয়া হিসাবে, রিয়েল টাইম পিসিআর প্রধানত ফ্লুরোসেন্স সিগন্যালের পরিবর্তনের মাধ্যমে পিসিআর অ্যামপ্লিফিকেশন প্রতিক্রিয়ার প্রতিটি চক্রে পরিবর্ধন পণ্যের পরিমাণের পরিবর্তনের উপর নজর রাখে এবং ct মান এবং স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখার মধ্যে সম্পর্কের মাধ্যমে প্রারম্ভিক টেমপ্লেটটি পরিমাণগতভাবে বিশ্লেষণ করে।
আরটি-পিসিআর-এর নির্দিষ্ট ডেটা হলভিত্তিরেখা, ফ্লুরোসেন্স থ্রেশহোল্ডএবংCt মান।
ভিত্তিরেখা: | 3য়-15 তম চক্রের ফ্লুরোসেন্স মান হল বেসলাইন (বেসলাইন), যা পরিমাপের মাঝে মাঝে ত্রুটির কারণে ঘটে। |
থ্রেশহোল্ড (থ্রেশহোল্ড): | প্রশস্তকরণ বক্ররেখার সূচকীয় বৃদ্ধি অঞ্চলে একটি উপযুক্ত অবস্থানে সেট করা প্রতিপ্রভ সনাক্তকরণ সীমা বোঝায়, সাধারণত বেসলাইনের মানক বিচ্যুতির 10 গুণ। |
সিটি মান: | এটি PCR চক্রের সংখ্যা যখন প্রতিটি প্রতিক্রিয়া টিউবের ফ্লুরোসেন্স মান থ্রেশহোল্ডে পৌঁছায়। Ct মানটি প্রাথমিক টেমপ্লেটের পরিমাণের বিপরীতভাবে সমানুপাতিক। |
RT-PCR-এর জন্য সাধারণ লেবেল পদ্ধতি:
পদ্ধতি | সুবিধা | অভাব | আবেদনের সুযোগ |
SYBR সবুজⅠ | ব্যাপক প্রযোজ্য, সংবেদনশীল, সস্তা এবং সুবিধাজনক | প্রাইমারের প্রয়োজনীয়তা বেশি, অ-নির্দিষ্ট ব্যান্ডের জন্য প্রবণ | এটি বিভিন্ন টার্গেট জিনের পরিমাণগত বিশ্লেষণ, জিনের অভিব্যক্তির উপর গবেষণা এবং ট্রান্সজেনিক রিকম্বিন্যান্ট প্রাণী ও উদ্ভিদের উপর গবেষণার জন্য উপযুক্ত। |
তাকমান | ভাল নির্দিষ্টতা এবং উচ্চ পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা | দাম বেশি এবং শুধুমাত্র নির্দিষ্ট লক্ষ্যের জন্য উপযুক্ত। | প্যাথোজেন সনাক্তকরণ, ড্রাগ প্রতিরোধের জিন গবেষণা, ওষুধের কার্যকারিতা মূল্যায়ন, জেনেটিক রোগ নির্ণয়। |
আণবিক বীকন | উচ্চ নির্দিষ্টতা, ফ্লুরোসেন্স, কম ব্যাকগ্রাউন্ড | দাম বেশি, এটি শুধুমাত্র একটি নির্দিষ্ট উদ্দেশ্যে উপযুক্ত, ডিজাইন কঠিন এবং দাম বেশি। | নির্দিষ্ট জিন বিশ্লেষণ, SNP বিশ্লেষণ |
2. পরীক্ষামূলক পদক্ষেপ
2.1 পরীক্ষামূলক গ্রুপিং সম্পর্কে- গ্রুপে একাধিক কূপ থাকতে হবে এবং জৈবিক পুনরাবৃত্তি থাকতে হবে।
① | ফাঁকা নিয়ন্ত্রণ | পরীক্ষায় কোষের বৃদ্ধির অবস্থা সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয় |
② | নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ siRNA (অ-নির্দিষ্ট siRNA ক্রম) | RNAi কর্মের নির্দিষ্টতা প্রদর্শন কর।siRNA 200nM ঘনত্বে অ-নির্দিষ্ট স্ট্রেস প্রতিক্রিয়া প্ররোচিত করতে পারে। |
③ | ট্রান্সফেকশন রিজেন্ট কন্ট্রোল | কোষে ট্রান্সফেকশন রিএজেন্টের বিষাক্ততা বা লক্ষ্য জিনের অভিব্যক্তির উপর প্রভাব বাদ দিন |
④ | টার্গেট জিনের বিরুদ্ধে siRNA | লক্ষ্য জিনের অভিব্যক্তি নক ডাউন |
⑤ (ঐচ্ছিক) | ইতিবাচক siRNA | পরীক্ষামূলক সিস্টেম এবং অপারেশনাল সমস্যা সমাধানের জন্য ব্যবহৃত হয় |
⑥ (ঐচ্ছিক) | ফ্লুরোসেন্ট নিয়ন্ত্রণ siRNA | অণুবীক্ষণ যন্ত্রের সাহায্যে কোষ স্থানান্তরের কার্যকারিতা লক্ষ্য করা যায় |
2.2 প্রাইমার ডিজাইনের নীতি
পরিবর্ধিত টুকরা আকার | বিশেষত 100-150bp এ |
প্রাইমার দৈর্ঘ্য | 18-25bp |
জিসি বিষয়বস্তু | 30%-70%, বিশেষত 45%-55% |
টিএম মান | 58-60℃ |
ক্রম | একটানা T/C এড়িয়ে চলুন;A/G একটানা |
3 শেষ ক্রম | GC সমৃদ্ধ বা AT সমৃদ্ধ এড়িয়ে চলুন;টার্মিনাল বেস পছন্দ করে জি বা সি;টি এড়িয়ে যাওয়াই ভালো |
পরিপূরকতা | প্রাইমারের মধ্যে বা দুটি প্রাইমারের মধ্যে 3টির বেশি বেসের পরিপূরক ক্রম এড়িয়ে চলুন |
বিশেষত্ব | প্রাইমারের নির্দিষ্টতা নিশ্চিত করতে বিস্ফোরণ অনুসন্ধান ব্যবহার করুন |
①SiRNA প্রজাতি-নির্দিষ্ট, এবং বিভিন্ন প্রজাতির ক্রম ভিন্ন হবে।
②SiRNA ফ্রিজ-শুকনো পাউডারে প্যাকেজ করা হয়, যা ঘরের তাপমাত্রায় 2-4 সপ্তাহের জন্য স্থিরভাবে সংরক্ষণ করা যেতে পারে।
2.3 সরঞ্জাম বা বিকারক যা আগে থেকে প্রস্তুত করা প্রয়োজন
প্রাইমার (অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স) | ফরোয়ার্ড এবং রিভার্স দুই সহ |
প্রাইমার (টার্গেট জিন) | ফরোয়ার্ড এবং রিভার্স দুই সহ |
টার্গেট Si RNA (3 স্ট্রিপ) | সাধারণত, কোম্পানি 3টি স্ট্রিপ সংশ্লেষিত করবে এবং তারপর RT-PCR দ্বারা তিনটির মধ্যে একটি বেছে নেবে। |
ট্রান্সফেকশন কিট | Lipo2000 ইত্যাদি |
আরএনএ র্যাপিড এক্সট্রাকশন কিট | স্থানান্তরের পরে আরএনএ নিষ্কাশনের জন্য |
র্যাপিড রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন কিট | সিডিএনএ সংশ্লেষণের জন্য |
পিসিআর পরিবর্ধন কিট | 2×সুপার এসওয়াইবিআর সবুজ qPCR মাস্টার মিক্স |
2.4 নির্দিষ্ট পরীক্ষামূলক পদক্ষেপগুলিতে যে বিষয়গুলিতে মনোযোগ দেওয়া দরকার সেগুলি সম্পর্কে:
①siRNA স্থানান্তর প্রক্রিয়া
1. কলাইয়ের জন্য, আপনি 24-ওয়েল প্লেট, 12-ওয়েল প্লেট বা 6-ওয়েল প্লেট বেছে নিতে পারেন (24-ওয়েল প্লেটের প্রতিটি কূপে প্রস্তাবিত গড় RNA ঘনত্ব প্রায় 100-300 ng/uL), এবং কোষের সর্বোত্তম স্থানান্তর ঘনত্ব 60% -80% পর্যন্ত
2. স্থানান্তর পদক্ষেপ এবং নির্দিষ্ট প্রয়োজনীয়তা কঠোরভাবে নির্দেশাবলী অনুযায়ী হয়.
3. স্থানান্তরের পরে, mRNA সনাক্তকরণ (RT-PCR) বা 48-96 ঘন্টার মধ্যে প্রোটিন সনাক্তকরণের জন্য 24-72 ঘন্টার মধ্যে নমুনা সংগ্রহ করা যেতে পারে (WB)
② RNA নিষ্কাশন প্রক্রিয়া
1. বহিরাগত এনজাইম দ্বারা দূষণ প্রতিরোধ করুন।এটি প্রধানত কঠোরভাবে মুখোশ এবং গ্লাভস পরা অন্তর্ভুক্ত;জীবাণুমুক্ত পাইপেট টিপস এবং ইপি টিউব ব্যবহার করে;পরীক্ষায় ব্যবহৃত জল অবশ্যই RNase-মুক্ত হতে হবে।
2. দ্রুত নিষ্কাশন কিটে প্রস্তাবিত হিসাবে এটি দ্বিগুণ করার সুপারিশ করা হয়, যা সত্যিই বিশুদ্ধতা এবং ফলন উন্নত করবে।
3. বর্জ্য তরল অবশ্যই আরএনএ কলাম স্পর্শ করবে না।
③ RNA পরিমাপ
আরএনএ বের করার পর, এটি সরাসরি Nanodrop দিয়ে পরিমাপ করা যেতে পারে, এবং সর্বনিম্ন রিডিং 10ng/ul-এর মতো কম হতে পারে।
④বিপরীত প্রতিলিপি প্রক্রিয়া
1. RT-qPCR-এর উচ্চ সংবেদনশীলতার কারণে, প্রতিটি নমুনার জন্য কমপক্ষে 3টি সমান্তরাল কূপ তৈরি করা উচিত যাতে পরবর্তী Ct খুব বেশি আলাদা না হয় বা পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণের জন্য SDটি খুব বড় না হয়।
2. মাস্টার মিক্স বারবার জমে ও গলাবেন না।
3. প্রতিটি টিউব/গর্ত অবশ্যই একটি নতুন টিপ দিয়ে প্রতিস্থাপন করতে হবে!নমুনা যোগ করার জন্য ক্রমাগত একই পাইপেট টিপ ব্যবহার করবেন না!
4. নমুনা যোগ করার পরে 96-ওয়েল প্লেটের সাথে সংযুক্ত ফিল্মটিকে একটি প্লেট দিয়ে মসৃণ করা দরকার।এটি মেশিনে রাখার আগে সেন্ট্রিফিউজ করা ভাল, যাতে টিউবের দেওয়ালে তরলটি নীচে প্রবাহিত হতে পারে এবং বায়ু বুদবুদগুলি অপসারণ করতে পারে।
⑤সাধারণ বক্ররেখা বিশ্লেষণ
লগারিদমিক বৃদ্ধির কোন সময়কাল | টেমপ্লেটের সম্ভবত উচ্চ ঘনত্ব |
CT মান নেই | ফ্লুরোসেন্ট সংকেত সনাক্তকরণের জন্য ভুল পদক্ষেপ; প্রাইমার বা প্রোবের অবক্ষয় - এর অখণ্ডতা PAGE ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা সনাক্ত করা যেতে পারে; টেমপ্লেট অপর্যাপ্ত পরিমাণ; টেমপ্লেটগুলির অবক্ষয় - নমুনা তৈরিতে অমেধ্য এবং বারবার জমাট বাঁধা এবং গলানো এড়ানো; |
Ct>38 | কম পরিবর্ধন দক্ষতা;পিসিআর পণ্য খুব দীর্ঘ;বিভিন্ন প্রতিক্রিয়া উপাদান ক্ষয়প্রাপ্ত হয় |
রৈখিক পরিবর্ধন বক্ররেখা | বারবার ফ্রিজ-থাও চক্র বা আলোর দীর্ঘায়িত এক্সপোজার দ্বারা প্রোবগুলি আংশিকভাবে হ্রাস পেতে পারে |
ডুপ্লিকেট গর্ত পার্থক্য বিশেষ করে বড় | প্রতিক্রিয়া দ্রবণ সম্পূর্ণরূপে গলিত হয় না বা প্রতিক্রিয়া দ্রবণ মিশ্রিত হয় না;পিসিআর যন্ত্রের তাপীয় স্নান ফ্লুরোসেন্ট পদার্থ দ্বারা দূষিত |
2.5 তথ্য বিশ্লেষণ সম্পর্কে
কিউপিসিআর-এর ডেটা বিশ্লেষণকে আপেক্ষিক পরিমাণ এবং পরম পরিমাণে ভাগ করা যেতে পারে।উদাহরণস্বরূপ, কন্ট্রোল গ্রুপের কোষগুলির সাথে তুলনা করে চিকিত্সা গ্রুপের কোষগুলি,
X জিনের mRNA কতবার পরিবর্তিত হয়, এটি আপেক্ষিক পরিমাপ;নির্দিষ্ট সংখ্যক কোষে, X জিনের mRNA
কত কপি আছে, এটি পরম পরিমাণ।সাধারণত আমরা ল্যাবরেটরিতে যা ব্যবহার করি তা হল আপেক্ষিক পরিমাণগত পদ্ধতি।সাধারণত,2-ΔΔct পদ্ধতিপরীক্ষায় সবচেয়ে বেশি ব্যবহৃত হয়, তাই শুধুমাত্র এই পদ্ধতিটি এখানে বিস্তারিতভাবে চালু করা হবে।
2-ΔΔct পদ্ধতি: প্রাপ্ত ফলাফল হ'ল কন্ট্রোল গ্রুপের লক্ষ্য জিনের তুলনায় পরীক্ষামূলক গ্রুপে লক্ষ্য জিনের অভিব্যক্তিতে পার্থক্য।লক্ষ্য জিন এবং অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিন উভয়ের পরিবর্ধন কার্যকারিতা 100% এর কাছাকাছি হওয়া প্রয়োজন এবং আপেক্ষিক বিচ্যুতি 5% এর বেশি হওয়া উচিত নয়।
গণনা পদ্ধতি নিম্নরূপ:
Δct কন্ট্রোল গ্রুপ = কন্ট্রোল গ্রুপে টার্গেট জিনের ct মান - কন্ট্রোল গ্রুপে অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিনের ct মান
Δct পরীক্ষামূলক গ্রুপ = পরীক্ষামূলক গ্রুপে লক্ষ্য জিনের ct মান - পরীক্ষামূলক গ্রুপে অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিনের ct মান
ΔΔct=Δct পরীক্ষামূলক গ্রুপ-Δct নিয়ন্ত্রণ গ্রুপ
অবশেষে, অভিব্যক্তি স্তরের পার্থক্যের একাধিক গণনা করুন:
ভাঁজ পরিবর্তন করুন = 2-ΔΔct (এক্সেল ফাংশনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ হল POWER)
সংশ্লিষ্ট পণ্য:
পোস্টের সময়: মে-20-2023