Ⅰ. প্রতিক্রিয়া সিস্টেমের সংবেদনশীলতা বৃদ্ধি করুন:
1. আলাদা উচ্চ-মানের RNA:
সফল সিডিএনএ সংশ্লেষণ উচ্চ-মানের আরএনএ থেকে আসে।উচ্চ-মানের আরএনএকে অন্তত মোট দীর্ঘ সময় নিশ্চিত করতে হবে এবং এতে EDTA বা SDS-এর মতো রেকর্ডিং এনজাইম নেই এমন ইনহিবিটর থাকে না।RNA-এর গুণমান সিডিএনএ-তে আপনি যে ক্রম তথ্য প্রতিলিপি করতে পারেন তার সর্বোচ্চ মান নির্ধারণ করে।সাধারণ আরএনএ পরিশোধন পদ্ধতি হল আইসোসায়ানেট/অ্যাসিডোফেনল ব্যবহারের একটি ধাপ পদ্ধতি।RNase-এর দূষণ রোধ করার জন্য, RNase সমৃদ্ধ একটি নমুনা থেকে আলাদা করা RNA (যেমন অগ্ন্যাশয়) উচ্চ-মানের RNA সংরক্ষণের জন্য ফর্মালডিহাইড সংরক্ষণের প্রয়োজন, যা দীর্ঘমেয়াদী স্টোরেজের জন্য আরও বেশি।ইঁদুরের যকৃত থেকে আহরিত আরএনএ মূলত পানিতে এক সপ্তাহ সংরক্ষণের পর অবনমিত হয়, যখন ইঁদুরের প্লীহা থেকে আহরিত আরএনএ তিন বছর পানিতে রাখার পর স্থিতিশীল থাকে।উপরন্তু, 4kb-এর থেকে বড় ট্রান্সক্রিপ্ট ছোট ট্রান্সক্রিপ্টের তুলনায় RNase ডিগ্রেডেশন ট্রেস করার জন্য বেশি সংবেদনশীল।স্টোরেজ আরএনএ নমুনার স্থায়িত্ব বাড়ানোর জন্য, আরএনএকে আয়নের মেথালমামিনে দ্রবীভূত করা যেতে পারে এবং -70 °সে সংরক্ষণ করা হয়।RNA সংরক্ষণ করতে ব্যবহৃত থাইলাইডে অবশ্যই RNA ক্ষয়কারী বিবিধ বস্তু থাকবে না।আরএনএ, যা অগ্ন্যাশয় থেকে প্রাপ্ত, মেথালমামিনে অন্তত এক বছরের জন্য সংরক্ষণ করা যেতে পারে।আপনি যখন আরএনএ ব্যবহার করার জন্য প্রস্তুত হন, তখন আপনি নিম্নলিখিত পদ্ধতিগুলি ব্যবহার করতে পারেন আরএনএকে প্ররোচিত করতে: 0.2 মি এবং ইথানলের আয়তনের 4 গুণে NaCl যোগ করুন, 3-5 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রা রাখুন এবং 5 মিনিটের জন্য 10,000 × গ্রাম কেন্দ্রাতিগ।
2. RNaseH কার্যকলাপ ছাড়া বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্ট ব্যবহার করুন (RNaseH-):
CDNA সংশ্লেষণের দৈর্ঘ্য এবং ফলন বাড়াতে RNase ইনহিবিটরগুলি প্রায়ই বিপরীত প্রতিলিপি বিক্রিয়ায় যোগ করা হয়।RNase ইনহিবিটর যুক্ত করা হয় প্রথম চেইন সংশ্লেষণ বিক্রিয়ায় বাফারের উপস্থিতিতে এবং DTT-এর মতো হ্রাসকারী এজেন্টের উপস্থিতিতে কারণ প্রাক-cDNA সংশ্লেষণ প্রক্রিয়া ইনহিবিটরকে ডিনেচার করে, যার ফলে RNA ক্ষয়কারী আবদ্ধ RNase মুক্ত হয়।প্রোটিন RNase ইনহিবিটর শুধুমাত্র RNase A, B, C দ্বারা RNA এর অবক্ষয় রোধ করে এবং ত্বকে RNase প্রতিরোধ করে না, তাই এই ইনহিবিটর ব্যবহার করা সত্ত্বেও আঙ্গুল থেকে RNase প্রবর্তন না করার জন্য যত্ন নেওয়া উচিত।
রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ আরএনএকে সিডিএনএ-তে রূপান্তরকে অনুঘটক করে।M-MLV এবং AMV উভয়েরই নিজস্ব পলিমারেজ ক্রিয়াকলাপ ছাড়াও অন্তঃসত্ত্বা RNaseH কার্যকলাপ রয়েছে।RNaseH কার্যকলাপ RNA টেমপ্লেট এবং DNA প্রাইমার বা cDNA এক্সটেনশন স্ট্র্যান্ডের মধ্যে গঠিত হেটেরোজাইগাস স্ট্র্যান্ডের জন্য পলিমারেজ কার্যকলাপের সাথে প্রতিদ্বন্দ্বিতা করে এবং RNA: RNA স্ট্র্যান্ডগুলি ডিএনএ কমপ্লেক্সে হ্রাস পায়।আরএনএ টেমপ্লেটগুলি আরএনএএসএইচ কার্যকলাপ দ্বারা অবনমিত হয়ে সিডিএনএ সংশ্লেষণের জন্য কার্যকর সাবস্ট্রেট হিসাবে ব্যবহার করা যায় না, সিডিএনএ সংশ্লেষণের ফলন এবং দৈর্ঘ্য হ্রাস করে।এইভাবে রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজের RNaseH কার্যকলাপ দূর করা বা ব্যাপকভাবে হ্রাস করা অনেক উপকারী হবে।
সুপারস্ক্রিপ্টⅡ রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ, RNaseH-এর MMLV রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ- এবং থার্মোস্ক্রিপ্ট রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ, RNaseH-এর AMV- MMLV এবং AMV-এর চেয়ে বেশি পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের সিডিএনএ দিয়েছে।RT-PCR সংবেদনশীলতা সিডিএনএ সংশ্লেষিত পরিমাণ দ্বারা প্রভাবিত হয়।থার্মোস্ক্রিপ্ট AMV এর চেয়ে অনেক বেশি সংবেদনশীল।RT-PCR পণ্যের আকার সিডিএনএ সংশ্লেষণ করার জন্য বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজের ক্ষমতা দ্বারা সীমিত, বিশেষ করে যখন বড় Cdna ক্লোন করা হয়।MMLV-এর সাথে তুলনা করে, SuperScripⅡ দীর্ঘ RT-PCR পণ্যের ফলন উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি করেছে।RNaseH- এর বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজ তাপীয় স্থিতিশীলতাও বাড়ায়, তাই প্রতিক্রিয়াটি স্বাভাবিকের চেয়ে বেশি তাপমাত্রায় 37-42℃ হতে পারে।প্রস্তাবিত সংশ্লেষণ অবস্থার অধীনে, অলিগো (ডিটি) প্রাইমার এবং 10μCi [আলফা-পি] ডিসিটিপি ব্যবহার করা হয়েছিল।প্রথম চেইনের মোট উৎপাদন TCA বৃষ্টিপাত পদ্ধতি ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল।পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের সিডিএনএ আকার-বাছাই করা স্ট্রিপ অপসারণ এবং একটি ক্ষারীয় অ্যাগারোজ জেলে গণনা ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
3. রিভার্স ট্রান্সক্রিপশনের তাপ সংরক্ষণ তাপমাত্রা বৃদ্ধি করুন:
উচ্চ ধারণ তাপমাত্রা RNA এর গৌণ কাঠামো খুলতে এবং বিক্রিয়ার ফলন বাড়াতে সাহায্য করে।বেশিরভাগ RNA টেমপ্লেটের জন্য, RNA এবং প্রাইমারকে বাফার বা লবণ ছাড়াই 65°C তাপমাত্রায় ধরে রাখা এবং তারপরে বরফের উপর দ্রুত ঠাণ্ডা করা অধিকাংশ গৌণ কাঠামোকে দূর করে এবং প্রাইমারগুলিকে বাঁধতে দেয়।যাইহোক, কিছু টেমপ্লেটের এখনও গৌণ কাঠামো রয়েছে, এমনকি তাপীয় বিকৃতকরণের পরেও।এই কঠিন টেমপ্লেটগুলির পরিবর্ধন থার্মোস্ক্রিপ্ট রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেস ব্যবহার করে এবং প্রশস্তকরণ উন্নত করতে উচ্চ তাপমাত্রায় বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজ বিক্রিয়া স্থাপন করে সঞ্চালিত হতে পারে।উচ্চ ধারণ তাপমাত্রাও নির্দিষ্টতা বাড়াতে পারে, বিশেষ করে যখন জিন-নির্দিষ্ট প্রাইমার (জিএসপিএস) ব্যবহার করে সিডিএনএ সংশ্লেষণ করা হয় (অধ্যায় 3 দেখুন)।GSP ব্যবহার করলে, নিশ্চিত করুন যে প্রাইমারের Tm মান প্রত্যাশিত ধারণ তাপমাত্রার সমান।60℃ এর উপরে অলিগো(dT) এবং এলোমেলো প্রাইমার ব্যবহার করবেন না।র্যান্ডম প্রাইমারগুলি 60℃-এ বাড়ানোর আগে 10 মিনিটের জন্য 25℃-এ রাখা দরকার।উচ্চতর বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন তাপমাত্রা ব্যবহার করার পাশাপাশি, RNA/ প্রাইমার মিশ্রণকে 65℃ ডিনাচারিং তাপমাত্রা থেকে রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন ধারণ তাপমাত্রায় সরাসরি স্থানান্তর করে এবং একটি প্রিহিটেড 2× প্রতিক্রিয়া মিশ্রণ (cDNA থার্মাল ইনিশিয়েশন সংশ্লেষণ) যোগ করে নির্দিষ্টতা উন্নত করা যেতে পারে।এই পদ্ধতিটি নিম্ন তাপমাত্রায় ঘটে এমন আন্তঃআণবিক বেস পেয়ারিং প্রতিরোধ করতে সাহায্য করে।একটি পিসিআর যন্ত্র ব্যবহার করা RT-PCR-এর জন্য প্রয়োজনীয় অনেকগুলি তাপমাত্রার সুইচকে সহজ করে।
Tth তাপ স্থিতিশীল পলিমারেজ Mg2+ এর উপস্থিতিতে DNA পলিমারেজ এবং Mn2+ এর উপস্থিতিতে RNA পলিমারেজ হিসাবে কাজ করে।এটি 65 ℃ পর্যন্ত তাপ ধরে রাখতে পারে।যাইহোক, PCR এর সময় Mn2+ এর উপস্থিতি বিশ্বস্ততা হ্রাস করে, যা Tth পলিমারেজকে উচ্চ নির্ভুলতা পরিবর্ধনের জন্য কম উপযুক্ত করে তোলে, যেমন cDNA ক্লোনিং।উপরন্তু, Tth বিপরীত প্রতিলিপিতে কম দক্ষ, যা সংবেদনশীলতা হ্রাস করে, এবং যেহেতু একটি একক এনজাইম বিপরীত প্রতিলিপি এবং PCR সম্পাদন করতে পারে, তাই বিপরীত প্রতিলিপি ছাড়া নিয়ন্ত্রণ প্রতিক্রিয়াগুলি দূষিত জিনোমিক ডিএনএ থেকে cDNA-এর পরিবর্ধিত পণ্যগুলিকে আলাদা করতে ব্যবহার করা যায় না।
4. সংযোজন যা বিপরীত প্রতিলিপি প্রচার করে:
প্রথম চেইন সংশ্লেষণ বিক্রিয়ায় গ্লিসারিন এবং DMSO সহ সংযোজন যুক্ত করা নিউক্লিক অ্যাসিড ডাবল স্ট্র্যান্ডের স্থায়িত্ব হ্রাস করতে পারে এবং আরএনএ সেকেন্ডারি কাঠামোকে মুক্ত করতে পারে।SuperScriptⅡ বা MMLV-এর কার্যকলাপকে প্রভাবিত না করে 20% পর্যন্ত গ্লিসারিন বা 10% DMSO যোগ করা যেতে পারে।AMV কার্যকলাপ হ্রাস না করে 20% পর্যন্ত গ্লিসারল সহ্য করতে পারে।সুপারস্ক্রিপ্টⅡ রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন প্রতিক্রিয়াতে RT-PCR-এর সংবেদনশীলতা সর্বাধিক করার জন্য, 10% গ্লিসারল যোগ করা যেতে পারে এবং 45℃ এ উত্তাপ করা যেতে পারে।যদি পিসিআর-এ রেট্রোট্রান্সক্রিপশন-প্রতিক্রিয়া পণ্যের 1/10 যোগ করা হয়, তবে পরিবর্ধন প্রতিক্রিয়াতে গ্লিসারলের ঘনত্ব 0.4% হয়, যা পিসিআরকে বাধা দেওয়ার জন্য যথেষ্ট নয়।
5. RNaseH প্রক্রিয়াকরণ:
পিসিআর-এর পূর্বে RNaseH-এর সাথে cDNA সংশ্লেষণ প্রতিক্রিয়ার চিকিত্সা করে সংবেদনশীলতা উন্নত করা যেতে পারে।কিছু টেমপ্লেটের জন্য, মনে করা হয় যে সিডিএনএ সংশ্লেষণ বিক্রিয়ায় আরএনএ পরিবর্ধিত পণ্যের বাঁধনকে বাধা দেয়, এই ক্ষেত্রে RNaseH চিকিত্সা সংবেদনশীলতা বাড়াতে পারে।সাধারণত, অপেক্ষাকৃত দীর্ঘ পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের cDNA টার্গেট টেমপ্লেটের পরিবর্ধনের জন্য RNaseH চিকিত্সার প্রয়োজন হয়, যেমন টিউবারাস স্কেরোসিসⅡ কম কপি সহ।এই কঠিন টেমপ্লেটের জন্য, RNaseH সুপারস্ক্রিপ্টⅡ বা AMV দ্বারা সংশ্লেষিত cDNA দ্বারা উত্পন্ন সংকেতকে উন্নত করেছে।বেশিরভাগ RT-PCR প্রতিক্রিয়ার জন্য, RNaseH চিকিত্সা ঐচ্ছিক কারণ 95℃ ইনসুলেটেড PCR ডিনাচুরেশন ধাপ সাধারণত RNA থেকে RNA: DNA কমপ্লেক্স হাইড্রোলাইজ করে।
6. অল্প পরিমাণে আরএনএ সনাক্ত করার জন্য উন্নত পদ্ধতি:
RT-PCR বিশেষভাবে চ্যালেঞ্জিং যখন শুধুমাত্র অল্প পরিমাণে আরএনএ পাওয়া যায়।আরএনএ পৃথকীকরণের সময় বাহক হিসাবে গ্লাইকোজেন সংযোজন ছোট নমুনার ফলন বাড়াতে সাহায্য করে।Trizol হিসাবে একই সময়ে একটি RNase-মুক্ত গ্লাইকোজেন যোগ করা যেতে পারে।গ্লাইকোজেন পানিতে দ্রবণীয় এবং পরবর্তী বর্ষণে সহায়তা করার জন্য RNA এর সাথে পানির পর্যায়ে থাকতে পারে।RNase-মুক্ত গ্লাইকোজেনের প্রস্তাবিত ঘনত্ব হল 250μg/ml টিস্যু বা 106টি কালচারড কোষের 50mg কম নমুনার জন্য।
SuperScriptⅡ ব্যবহার করে বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন প্রতিক্রিয়ার জন্য অ্যাসিটাইলেটেড BSA সংযোজন সংবেদনশীলতা বাড়াতে পারে, এবং অল্প পরিমাণে RNA-এর জন্য, SuperScriptⅡ-এর পরিমাণ কমিয়ে এবং RnaseOut নিউক্লিজ ইনহিবিটর-এর 40 ইউনিট যোগ করা সনাক্তকরণের স্তরকে উন্নত করতে পারে।যদি আরএনএ পৃথকীকরণে গ্লাইকোজেন ব্যবহার করা হয়, তবে সুপারস্ক্রিপ্টⅡ ব্যবহার করে ট্রান্সক্রিপশন প্রতিক্রিয়া বিপরীত করতে BSA বা RNase ইনহিবিটর যুক্ত করার পরামর্শ দেওয়া হয়।
Ⅱ. RT-PCR এর নির্দিষ্টতা বাড়ান
1. সিএনডিএ সংশ্লেষণ:
প্রথম স্ট্র্যান্ড সিডিএনএ সংশ্লেষণ শুরু করার জন্য তিনটি ভিন্ন পদ্ধতি ব্যবহার করা যেতে পারে এবং প্রতিটি পদ্ধতির আপেক্ষিক নির্দিষ্টতা সিডিএনএ সংশ্লেষিত পরিমাণ এবং প্রকারকে প্রভাবিত করে।
র্যান্ডম প্রাইমার পদ্ধতি তিনটি পদ্ধতির মধ্যে সর্বনিম্ন নির্দিষ্ট।ছোট, আংশিক দৈর্ঘ্যের সিডিএনএ তৈরি করতে ট্রান্সক্রিপ্ট জুড়ে প্রাইমারগুলি একাধিক সাইটে অ্যানিল করা হয়।এই পদ্ধতিটি প্রায়শই 5′ টার্মিনাল সিকোয়েন্স এবং সিডিএনএ প্রাপ্ত করতে ব্যবহৃত হয় আরএনএ টেমপ্লেটগুলি থেকে গৌণ কাঠামোগত অঞ্চলগুলির সাথে বা সমাপ্ত সাইটগুলির সাথে যা বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজ প্রতিলিপি করতে পারে না।দীর্ঘতম সিডিএনএ পাওয়ার জন্য, প্রতিটি আরএনএ নমুনায় প্রাইমারের আরএনএর অনুপাত পরীক্ষামূলকভাবে নির্ধারণ করা প্রয়োজন।এলোমেলো প্রাইমারগুলির প্রাথমিক ঘনত্ব প্রতি 20μl প্রতিক্রিয়া সিস্টেমে 50 থেকে 250ng পর্যন্ত।কারণ এলোমেলো প্রাইমার ব্যবহার করে মোট RNA থেকে সংশ্লেষিত cDNA মূলত রাইবোসোমাল RNA, পলি(A)+RNA সাধারণত টেমপ্লেট হিসেবে নির্বাচিত হয়।
অলিগো(ডিটি) দীক্ষা এলোমেলো প্রাইমারের চেয়ে বেশি নির্দিষ্ট।এটি বেশিরভাগ ইউক্যারিওটিক কোষে mRNA এর 3′ প্রান্তে পাওয়া পলি(A) লেজের সাথে সংকর করে।যেহেতু পলি(এ)+আরএনএ মোট আরএনএর প্রায় 1% থেকে 2%, সিডিএনএর পরিমাণ এবং জটিলতা যদি এলোমেলো প্রাইমার ব্যবহার করা হয় তার চেয়ে অনেক কম।উচ্চ সুনির্দিষ্টতার কারণে, অলিগো(dT) এর জন্য সাধারণত RNA থেকে প্রাইমার অনুপাত এবং পলি(A)+ নির্বাচনের জন্য অপ্টিমাইজেশনের প্রয়োজন হয় না।প্রতি 20μl প্রতিক্রিয়া সিস্টেমে 0.5μg oligo(dT) ব্যবহার করার পরামর্শ দেওয়া হয়।oligo(dT)12-18 বেশিরভাগ RT-PCR এর জন্য উপযুক্ত।ThermoScript RT-PCR সিস্টেম অলিগো(dT)20 প্রদান করে কারণ এর ভালো তাপীয় স্থিতিশীলতা এবং উচ্চ ধারণ তাপমাত্রার জন্য উপযুক্ত।
জিন-নির্দিষ্ট প্রাইমার (GSP) হল রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন ধাপের জন্য সেরা নির্দিষ্ট প্রাইমার।জিএসপি হল একটি অ্যান্টিসেন্স অলিগোনিউক্লিওসাইড যা বিশেষভাবে আরএনএ গন্তব্য ক্রমগুলির সাথে হাইব্রিডাইজ করতে পারে, র্যান্ডম প্রাইমার বা অলিগো(ডিটি) এর মতো সমস্ত আরএনএ অ্যানিল করার পরিবর্তে।পিসিআর প্রাইমার ডিজাইন করতে ব্যবহৃত নিয়মগুলি বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন প্রতিক্রিয়া জিএসপি ডিজাইনের ক্ষেত্রেও প্রযোজ্য।জিএসপি এমআরএনএ3′-এর শেষে অ্যামপ্লিফিকেশন প্রাইমার অ্যানিল করা একই ক্রম হতে পারে, অথবা জিএসপিকে রিভার্স অ্যামপ্লিফিকেশন প্রাইমারের সাথে ডাউনস্ট্রিম অ্যানিল করার জন্য ডিজাইন করা যেতে পারে।কিছু পরিবর্ধিত বস্তুর জন্য, সফল RT-PCR-এর জন্য একাধিক অ্যান্টিসেন্স প্রাইমার ডিজাইন করা প্রয়োজন কারণ লক্ষ্য RNA-এর গৌণ কাঠামো প্রাইমারকে বাঁধা হতে বাধা দিতে পারে।20μl এর প্রথম চেইন সংশ্লেষণ প্রতিক্রিয়া পদ্ধতিতে 1pmol antisense GSP ব্যবহার করার পরামর্শ দেওয়া হয়।
2. রিভার্স ট্রান্সক্রিপশনের তাপ সংরক্ষণ তাপমাত্রা বৃদ্ধি করুন:
জিএসপি নির্দিষ্টতার সম্পূর্ণ সুবিধা নিতে, উচ্চ তাপীয় স্থিতিশীলতার সাথে বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্ট ব্যবহার করা উচিত।তাপ-স্থিতিশীল বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজ প্রতিক্রিয়া কঠোরতা বাড়ানোর জন্য উচ্চ তাপমাত্রায় উত্তাপ করা যেতে পারে।উদাহরণস্বরূপ, যদি একটি GSP 55°C এ অ্যানিল করা হয়, তাহলে AMV বা M-MLV ব্যবহার করে কম কঠোরতার সাথে বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন 37°C এ সঞ্চালিত হলে GSP-এর নির্দিষ্টতা সম্পূর্ণরূপে ব্যবহার করা হয় না।যাইহোক, SuperScripⅡ এবং ThermoScript 50℃ বা তার বেশি তাপমাত্রায় প্রতিক্রিয়া জানাতে পারে, যা নিম্ন তাপমাত্রায় উত্পাদিত অ-নির্দিষ্ট পণ্যগুলিকে সরিয়ে দেয়।সর্বাধিক নির্দিষ্টতার জন্য, আরএনএ/প্রাইমার মিশ্রণটি 65℃ ডিনাচুরেশন তাপমাত্রা থেকে একটি প্রিহিটেড 2 x প্রতিক্রিয়া মিশ্রণ (cDNA সংশ্লেষণের তাপীয় সূচনা) যোগ করে বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন হোল্ডিং তাপমাত্রায় সরাসরি স্থানান্তর করা যেতে পারে।এটি কম তাপমাত্রায় অণুর মধ্যে বেস পেয়ারিং প্রতিরোধ করতে সাহায্য করে।একটি পিসিআর যন্ত্র ব্যবহার করা RT-PCR-এর জন্য প্রয়োজনীয় অনেক তাপমাত্রা পরিবর্তনকে সহজ করে।
3. জিনোমিক ডিএনএ দূষণ হ্রাস করুন:
RT-PCR এর একটি সম্ভাব্য অসুবিধা হল RNA জিনোমিক DNA দূষিত করে।উন্নত আরএনএ বিচ্ছেদ পদ্ধতির ব্যবহার, যেমন ট্রিজল রিএজেন্ট, আরএনএ প্রস্তুতিতে জিনোমিক ডিএনএ দূষণ হ্রাস করে।জিনোমিক ডিএনএ থেকে উৎপাদিত পণ্য এড়াতে, বিপরীত প্রতিলিপির আগে দূষিত ডিএনএ অপসারণের জন্য RNA-কে পরিবর্ধন গ্রেড DnasⅠ দিয়ে চিকিত্সা করা যেতে পারে।DNaseⅠ হজম বন্ধ করার জন্য নমুনাগুলিকে 2.0mM EDTA-তে 10 মিনিটের জন্য 65℃ এ রাখা হয়েছিল।উচ্চ তাপমাত্রায় ঘটে যাওয়া ম্যাগনেসিয়াম আয়ন নির্ভর আরএনএ হাইড্রোলাইসিস প্রতিরোধ করতে EDTA ম্যাগনেসিয়াম আয়নগুলিকে চেলেট করে।
জিনোম ডিএনএ পরিবর্ধন পণ্য থেকে পরিবর্ধিত সিডিএনএ পৃথক করার জন্য, প্রাইমারগুলি যা পৃথক করা এক্সন দিয়ে আলাদাভাবে অ্যানিল করে ডিজাইন করা যেতে পারে।সিডিএনএ থেকে প্রাপ্ত পিসিআর পণ্যগুলি দূষিত জিনোমিক ডিএনএ থেকে প্রাপ্ত পণ্যগুলির চেয়ে ছোট হবে।প্রদত্ত খণ্ডটি জিনোমিক ডিএনএ বা সিডিএনএ থেকে কিনা তা নির্ধারণ করতে প্রতিটি আরএনএ টেমপ্লেটে বিপরীত প্রতিলিপি ছাড়া একটি নিয়ন্ত্রিত পরীক্ষাও করা হয়।বিপরীত প্রতিলিপির অনুপস্থিতিতে প্রাপ্ত পিসিআর পণ্যগুলি জিনোম থেকে প্রাপ্ত।
সংশ্লিষ্ট পণ্য
-এক-পদক্ষেপের কিটটি বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন এবং পিসিআর একই টিউবে বাহিত করতে সক্ষম করে।এটি শুধুমাত্র টেমপ্লেট RNA, নির্দিষ্ট PCR প্রাইমার এবং RNase-মুক্ত ddH যোগ করতে হবে2O.
RNA-এর রিয়েল-টাইম পরিমাণগত বিশ্লেষণ দ্রুত এবং নির্ভুলভাবে করা যেতে পারে।
-কিটটি একটি অনন্য ফোরজিন রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন রিএজেন্ট এবং ফোরজিন হটস্টার টাক ডিএনএ পলিমারেজ ব্যবহার করে একটি অনন্য প্রতিক্রিয়া সিস্টেমের সাথে একত্রিত করে কার্যকরভাবে প্রতিক্রিয়াটির পরিবর্ধন দক্ষতা এবং নির্দিষ্টতা উন্নত করতে।
-অপ্টিমাইজ করা প্রতিক্রিয়া সিস্টেম প্রতিক্রিয়াটিকে উচ্চতর সনাক্তকরণ সংবেদনশীলতা, শক্তিশালী তাপীয় স্থিতিশীলতা এবং আরও ভাল সহনশীলতা তৈরি করে।
-জিডিএনএ অপসারণ করার দক্ষ ক্ষমতা, যা 2 মিনিটের মধ্যে টেমপ্লেটে জিডিএনএ অপসারণ করতে পারে।
-দক্ষ বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন সিস্টেম, এটি প্রথম স্ট্র্যান্ড cDNA এর সংশ্লেষণ সম্পূর্ণ করতে মাত্র 15 মিনিট সময় নেয়।
-জটিল টেমপ্লেট: উচ্চ GC বিষয়বস্তু এবং জটিল গৌণ কাঠামো সহ টেমপ্লেটগুলিও উচ্চ দক্ষতার সাথে বিপরীত করা যেতে পারে।
-উচ্চ-সংবেদনশীলতা বিপরীত প্রতিলিপি সিস্টেম, পিজি-স্তরের টেমপ্লেটগুলিও উচ্চ-মানের সিডিএনএ পেতে পারে।
-রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন সিস্টেমের উচ্চ তাপীয় স্থিতিশীলতা রয়েছে, সর্বোত্তম প্রতিক্রিয়া তাপমাত্রা 42℃, এবং এটি এখনও 50℃ এ ভাল বিপরীত প্রতিলিপি কার্যকারিতা রয়েছে।
পোস্টের সময়: মার্চ-০৭-২০২৩
