RT-qPCR সাধারণ PCR প্রযুক্তি থেকে তৈরি করা হয়েছে।এটি প্রথাগত পিসিআর প্রতিক্রিয়া সিস্টেমে ফ্লুরোসেন্ট রাসায়নিক (ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জক বা ফ্লুরোসেন্ট প্রোব) যুক্ত করে এবং তাদের বিভিন্ন লুমিনসেন্ট প্রক্রিয়া অনুসারে বাস্তব সময়ে পিসিআর অ্যানিলিং এবং এক্সটেনশন প্রক্রিয়া সনাক্ত করে।PCR-এর প্রতিটি চক্রে পণ্যের পরিবর্তনের পরিমাণ গণনা করতে মাধ্যমের ফ্লুরোসেন্ট সংকেত পরিবর্তনগুলি ব্যবহার করা হয়।বর্তমানে, সবচেয়ে সাধারণ পদ্ধতি হল ফ্লুরোসেন্ট ডাই পদ্ধতি এবং প্রোব পদ্ধতি।

ফ্লুরোসেন্ট ডাই পদ্ধতি:
কিছু ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জক, যেমন SYBR সবুজ Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ইত্যাদি, নিজের দ্বারা আলো নির্গত করে না, কিন্তু dsDNA-এর ছোট খাঁজের সাথে আবদ্ধ হওয়ার পরে ফ্লুরোসেন্ট নির্গত করে।অতএব, পিসিআর প্রতিক্রিয়ার শুরুতে, মেশিনটি ফ্লুরোসেন্ট সংকেত সনাক্ত করতে পারে না।যখন প্রতিক্রিয়া অ্যানিলিং-এক্সটেনশন (দুই-পদক্ষেপ পদ্ধতি) বা এক্সটেনশন পর্যায়ে (তিন-পদক্ষেপ পদ্ধতি) এগিয়ে যায়, তখন ডাবল স্ট্র্যান্ডগুলি খোলা হয়, এবং নতুন ডিএনএ পলিমারেজ স্ট্র্যান্ড সংশ্লেষণের সময়, ফ্লুরোসেন্ট অণুগুলি dsDNA মাইনর গ্রুভের মধ্যে মিলিত হয় এবং ফ্লুরোস নির্গত হয়।PCR চক্রের সংখ্যা বাড়ার সাথে সাথে dsDNA এর সাথে আরও বেশি রঞ্জক মিলিত হয় এবং ফ্লুরোসেন্ট সংকেতও ক্রমাগত উন্নত হয়।একটি উদাহরণ হিসাবে SYBR সবুজ Ⅰ নিন।
অনুসন্ধান পদ্ধতি:
তাকমান প্রোব হল সবচেয়ে বেশি ব্যবহৃত হাইড্রোলাইসিস প্রোব।প্রোবের 5′ প্রান্তে একটি ফ্লুরোসেন্ট গ্রুপ আছে, সাধারণত FAM।প্রোব নিজেই টার্গেট জিনের পরিপূরক একটি ক্রম।ফ্লুরোফোরের 3′ প্রান্তে একটি ফ্লুরোসেন্ট নিভানোর গ্রুপ রয়েছে।ফ্লুরোসেন্স রেজোন্যান্স এনার্জি ট্রান্সফারের নীতি অনুসারে (Förster রেজোন্যান্স এনার্জি ট্রান্সফার, FRET), যখন রিপোর্টার ফ্লুরোসেন্ট গ্রুপ (দাতা ফ্লুরোসেন্ট অণু) এবং quenching ফ্লুরোসেন্ট গ্রুপ (গ্রহণকারী ফ্লুরোসেন্ট অণু) যখন উত্তেজনা স্পেকট্রাম ওভারল্যাপ হয় এবং দূরত্ব খুব কাছাকাছি হয়, তখন দূরত্ব খুব কাছাকাছি হতে পারে। গ্রহণকারী অণুর ফ্লুরোসেন্স, যখন অটোফ্লুরেসেন্স দুর্বল হয়।অতএব, পিসিআর প্রতিক্রিয়ার শুরুতে, যখন প্রোবটি সিস্টেমে বিনামূল্যে এবং অক্ষত থাকে, তখন রিপোর্টার ফ্লুরোসেন্ট গ্রুপ ফ্লুরোসেন্স নির্গত করবে না।অ্যানিলিং করার সময়, প্রাইমার এবং প্রোব টেমপ্লেটের সাথে আবদ্ধ হয়।এক্সটেনশন পর্যায়ে, পলিমারেজ ক্রমাগত নতুন চেইন সংশ্লেষিত করে।ডিএনএ পলিমারেজের 5′-3′ এক্সোনিউক্লিজ কার্যকলাপ রয়েছে।প্রোবের কাছে পৌঁছানোর সময়, ডিএনএ পলিমারেজ টেমপ্লেট থেকে প্রোবটিকে হাইড্রোলাইজ করবে, প্রতিবেদক ফ্লুরোসেন্ট গ্রুপকে quencher ফ্লুরোসেন্ট গ্রুপ থেকে আলাদা করবে এবং ফ্লুরোসেন্ট সংকেত প্রকাশ করবে।যেহেতু প্রোব এবং টেমপ্লেটের মধ্যে এক-এক সম্পর্ক রয়েছে, তাই পরীক্ষার নির্ভুলতা এবং সংবেদনশীলতার দিক থেকে প্রোব পদ্ধতিটি ডাই পদ্ধতির চেয়ে উচ্চতর।

চিত্র 1 কিউআরটি-পিসিআর-এর নীতি

প্রাইমার ডিজাইন
নীতিমালা:

প্রাইমারগুলি নিউক্লিক অ্যাসিড সিরিজের সংরক্ষিত অঞ্চলে ডিজাইন করা উচিত এবং নির্দিষ্টতা থাকতে হবে।

সিডিএনএ সিকোয়েন্স ব্যবহার করা ভালো এবং এমআরএনএ সিকোয়েন্সও গ্রহণযোগ্য।যদি না হয়, ডিএনএ সিকোয়েন্সের সিডিএস অঞ্চলের নকশাটি সন্ধান করুন।
ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পণ্যের দৈর্ঘ্য 80-150bp, দীর্ঘতম 300bp, প্রাইমারের দৈর্ঘ্য সাধারণত 17-25 বেসের মধ্যে, এবং আপস্ট্রিম এবং ডাউনস্ট্রিম প্রাইমারের মধ্যে পার্থক্য খুব বেশি হওয়া উচিত নয়।

G+C বিষয়বস্তু 40% থেকে 60% এর মধ্যে এবং 45-55% হল সেরা৷
TM মান 58-62 ডিগ্রির মধ্যে।
প্রাইমার ডাইমার এবং সেলফ-ডাইমার এড়াতে চেষ্টা করুন, (পরপর 4 জোড়ার বেশি পরিপূরক বেস দেখাবেন না) হেয়ারপিনের গঠন, যদি অনিবার্য হয়, ΔG<4.5kJ/mol* করুন যদি আপনি নিশ্চিত করতে না পারেন যে জিডিএনএ রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন ক্লিন করার সময় সরানো হয়েছে, তাহলে ইন্ট্রনের প্রাইমারগুলি ডিজাইন করা ভাল, জিএটি এড়ানো যায় না, জিএটি এড়ানো যায় না। /C, A/G ক্রমাগত কাঠামো (2-3) প্রাইমার এবং অ-
নির্দিষ্ট ভিন্ন ভিন্নভাবে পরিবর্ধিত অনুক্রমের হোমোলজি 70% এর কম বা 8টি পরিপূরক বেস হোমোলজি আছে।
তথ্যশালা:
কীওয়ার্ড দ্বারা কটনএফজিডি অনুসন্ধান করুন
প্রাইমার ডিজাইন:
IDT-qPCR প্রাইমার ডিজাইন

Fig2 IDT অনলাইন প্রাইমার ডিজাইন টুল পৃষ্ঠা

Fig3 ফলাফল পৃষ্ঠা প্রদর্শন
lncRNA প্রাইমারের ডিজাইন:
lncRNA:mRNA হিসাবে একই পদক্ষেপ।
miRNA:স্টেম-লুপ পদ্ধতির নীতি: যেহেতু সমস্ত miRNA প্রায় 23 nt এর সংক্ষিপ্ত ক্রম, তাই সরাসরি পিসিআর সনাক্তকরণ করা যায় না, তাই স্টেম-লুপ সিকোয়েন্স টুল ব্যবহার করা হয়।স্টেম-লুপ সিকোয়েন্স হল প্রায় 50 এনটি এর একক-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ, যা নিজেই একটি হেয়ারপিন গঠন তৈরি করতে পারে।3 'শেষটি miRNA আংশিক খণ্ডের পরিপূরক একটি ক্রম হিসাবে ডিজাইন করা যেতে পারে, তারপর লক্ষ্য miRNA কে বিপরীত প্রতিলিপির সময় স্টেম-লুপ সিকোয়েন্সের সাথে সংযুক্ত করা যেতে পারে এবং মোট দৈর্ঘ্য 70bp এ পৌঁছাতে পারে, যা qPCR দ্বারা নির্ধারিত পরিবর্ধিত পণ্যের দৈর্ঘ্যের সাথে সঙ্গতিপূর্ণ।টেলিং miRNA প্রাইমার ডিজাইন।
পরিবর্ধন-নির্দিষ্ট সনাক্তকরণ:
অনলাইন ব্লাস্ট ডাটাবেস: সিকোয়েন্স সাদৃশ্য দ্বারা কটনএফজিডি বিস্ফোরণ
স্থানীয় ব্লাস্ট: স্থানীয় ব্লাস্ট করতে Blast+ ব্যবহার করুন, লিনাক্স এবং ম্যাকো সরাসরি একটি স্থানীয় ডাটাবেস স্থাপন করতে পারে, উবুন্টু ব্যাশ ইনস্টল করার পরেও win10 সিস্টেম করা যেতে পারে।স্থানীয় বিস্ফোরণ ডাটাবেস এবং স্থানীয় বিস্ফোরণ তৈরি করুন;win10 এ উবুন্টু ব্যাশ খুলুন।
দ্রষ্টব্য: উচ্চভূমির তুলা এবং সমুদ্র দ্বীপের তুলা টেট্রাপ্লয়েড ফসল, তাই বিস্ফোরণের ফলাফল প্রায়শই দুই বা ততোধিক ম্যাচ হবে।অতীতে, ব্লাস্ট সঞ্চালনের জন্য ডাটাবেস হিসাবে NAU cds ব্যবহার করলে শুধুমাত্র কয়েকটি SNP পার্থক্য সহ দুটি সমজাতীয় জিন পাওয়া যায়।সাধারণত, দুটি সমজাতীয় জিন প্রাইমার ডিজাইন দ্বারা আলাদা করা যায় না, তাই তাদের একই হিসাবে বিবেচনা করা হয়।যদি একটি সুস্পষ্ট ইনডেল থাকে, তাহলে প্রাইমারটি সাধারণত ইনডেলের উপর ডিজাইন করা হয়, তবে এটি প্রাইমারের গৌণ কাঠামোর দিকে নিয়ে যেতে পারে মুক্ত শক্তি উচ্চতর হয়ে যায়, যার ফলে পরিবর্ধন দক্ষতা হ্রাস পায়, তবে এটি অনিবার্য।

প্রাইমার সেকেন্ডারি স্ট্রাকচার সনাক্তকরণ:
ধাপ:ওপেন অলিগো 7 → ইনপুট টেমপ্লেট সিকোয়েন্স → সাব-উইন্ডো বন্ধ করুন → সেভ করুন → টেমপ্লেটে প্রাইমার সনাক্ত করুন, প্রাইমারের দৈর্ঘ্য সেট করতে ctrl+D টিপুনসামনের প্রাইমারের ফলাফল ভাল, কোন সুস্পষ্ট ডাইমার এবং হেয়ারপিন গঠন নেই, কোন অবিচ্ছিন্ন পরিপূরক ঘাঁটি নেই এবং মুক্ত শক্তির পরম মান 4.5 এর কম, যখন পিছনের প্রাইমারটি অবিচ্ছিন্ন দেখায় 6টি বেস পরিপূরক, এবং মুক্ত শক্তি 8.8;উপরন্তু, একটি আরো গুরুতর ডাইমার 3′ শেষে প্রদর্শিত হয়, এবং 4 টানা বেসের একটি ডাইমার প্রদর্শিত হয়।যদিও মুক্ত শক্তি বেশি নয়, 3′ ডাইমার Chl প্রশস্তকরণের নির্দিষ্টতা এবং পরিবর্ধন দক্ষতাকে গুরুতরভাবে প্রভাবিত করতে পারে।উপরন্তু, hairpins, heterodimers, এবং অমিল জন্য চেক করা প্রয়োজন।

Fig3 oligo7 সনাক্তকরণ ফলাফল
পরিবর্ধন দক্ষতা সনাক্তকরণ:
PCR প্রতিক্রিয়ার পরিবর্ধন দক্ষতা PCR ফলাফলকে গুরুতরভাবে প্রভাবিত করে।এছাড়াও qRT-PCR-তে, পরিবর্ধন দক্ষতা পরিমাণগত ফলাফলের জন্য বিশেষভাবে গুরুত্বপূর্ণ।প্রতিক্রিয়া বাফারে অন্যান্য পদার্থ, মেশিন এবং প্রোটোকলগুলি সরান।প্রাইমারের গুণমান কিউআরটি-পিসিআর-এর পরিবর্ধন দক্ষতার উপরও দারুণ প্রভাব ফেলে।ফলাফলের যথার্থতা নিশ্চিত করার জন্য, আপেক্ষিক ফ্লুরোসেন্স কোয়ান্টিফিকেশন এবং পরম ফ্লুরোসেন্স কোয়ান্টিফিকেশন উভয়কেই প্রাইমারগুলির পরিবর্ধন দক্ষতা সনাক্ত করতে হবে।এটি স্বীকৃত যে কার্যকর qRT-PCR পরিবর্ধন দক্ষতা 85% এবং 115% এর মধ্যে।দুটি পদ্ধতি আছে:
1. স্ট্যান্ডার্ড কার্ভ পদ্ধতি:
কসিডিএনএ মেশান
খ.গ্রেডিয়েন্ট পাতলা
c.qPCR
dপরিবর্ধন দক্ষতা গণনা করতে লিনিয়ার রিগ্রেশন সমীকরণ
2. LinRegPCR
LinRegPCR হল রিয়েল টাইম RT-PCR ডেটা বিশ্লেষণের জন্য একটি প্রোগ্রাম, যাকে SYBR সবুজ বা অনুরূপ রসায়নের উপর ভিত্তি করে পরিমাণগত PCR (qPCR) ডেটাও বলা হয়।প্রোগ্রামটি নন-বেসলাইন সংশোধিত ডেটা ব্যবহার করে, প্রতিটি নমুনাতে পৃথকভাবে একটি বেসলাইন সংশোধন করে, একটি উইন্ডো-অফ-লিনিয়ারিটি নির্ধারণ করে এবং তারপর পিসিআর ডেটা সেটের মাধ্যমে একটি সরল রেখায় ফিট করার জন্য লিনিয়ার রিগ্রেশন বিশ্লেষণ ব্যবহার করে।এই লাইনের ঢাল থেকে প্রতিটি পৃথক নমুনার পিসিআর দক্ষতা গণনা করা হয়।প্রতি অ্যামপ্লিকনের গড় PCR দক্ষতা এবং প্রতি নমুনা প্রতি Ct মান প্রতি নমুনা একটি প্রারম্ভিক ঘনত্ব গণনা করতে ব্যবহৃত হয়, যা নির্বিচারে ফ্লুরোসেন্স ইউনিটে প্রকাশ করা হয়।ডেটা ইনপুট এবং আউটপুট একটি এক্সেল স্প্রেডশীটের মাধ্যমে হয়।শুধুমাত্র নমুনা
মিশ্রণ প্রয়োজন, কোন গ্রেডিয়েন্ট
পদক্ষেপ প্রয়োজন:(একটি উদাহরণ হিসাবে বোলে CFX96 নিন, পরিষ্কার ABI সহ সম্পূর্ণ মেশিন নয়)
পরীক্ষা:এটি একটি আদর্শ qPCR পরীক্ষা।
qPCR ডেটা আউটপুট:LinRegPCR আউটপুট ফাইলের দুটি ফর্ম চিনতে পারে: RDML বা পরিমাপ পরিবর্ধন ফলাফল।প্রকৃতপক্ষে, এটি মেশিন দ্বারা চক্র নম্বর এবং ফ্লুরোসেন্স সংকেতের রিয়েল-টাইম সনাক্তকরণ মান এবং রৈখিক সেগমেন্ট দক্ষতার ফ্লুরোসেন্স পরিবর্তন মান বিশ্লেষণ করে পরিবর্ধন প্রাপ্ত হয়।
ডেটা নির্বাচন: তাত্ত্বিকভাবে, RDML মান ব্যবহারযোগ্য হওয়া উচিত।এটি অনুমান করা হয় যে আমার কম্পিউটারের সমস্যা হল যে সফ্টওয়্যারটি RDML চিনতে পারে না, তাই আমার কাছে আসল ডেটা হিসাবে এক্সেল আউটপুট মান রয়েছে।প্রথমে ডেটার মোটামুটি স্ক্রীনিং করার পরামর্শ দেওয়া হয়, যেমন নমুনা যোগ করতে ব্যর্থ হওয়া ইত্যাদি। পয়েন্টগুলি আউটপুট ডেটাতে মুছে ফেলা যেতে পারে (অবশ্যই, আপনি সেগুলি মুছতে পারবেন না, LinRegPCR পরবর্তী পর্যায়ে এই পয়েন্টগুলি উপেক্ষা করবে)

চিত্র 5 qPCR ডেটা এক্সপোর্ট

Fig6 প্রার্থীর নমুনার নির্বাচন

ডাটা প্রবেশ:ওপেন যোগ্যতা পরিবর্ধন ফলাফল.xls, → LinRegPCR খুলুন → ফাইল → এক্সেল থেকে পড়ুন → চিত্র 7 → ঠিক আছে → বেসলাইন নির্ধারণ করুন ক্লিক করুন

linRegPCR ডেটা ইনপুটের চিত্র 7 ধাপ

ফলাফল:যদি কোন পুনরাবৃত্তি না হয়, কোন গ্রুপিং প্রয়োজন হয় না।যদি পুনরাবৃত্তি হয়, নমুনা গ্রুপিং এ গোষ্ঠীকরণ সম্পাদনা করা যেতে পারে, এবং জিনের নাম শনাক্তকারীতে প্রবেশ করানো হয়, এবং তারপর একই জিন স্বয়ংক্রিয়ভাবে গোষ্ঠীবদ্ধ হবে।অবশেষে, ফাইলটিতে ক্লিক করুন, এক্সেল এক্সপোর্ট করুন এবং ফলাফল দেখুন।প্রতিটি কূপের পরিবর্ধন দক্ষতা এবং R2 ফলাফল প্রদর্শিত হবে।দ্বিতীয়ত, যদি আপনি গ্রুপে বিভক্ত হন, সংশোধন করা গড় পরিবর্ধন দক্ষতা প্রদর্শিত হবে।নিশ্চিত করুন যে প্রতিটি প্রাইমারের পরিবর্ধন দক্ষতা 85% এবং 115% এর মধ্যে।যদি এটি খুব বড় বা খুব ছোট হয়, তাহলে এর অর্থ হল প্রাইমারের পরিবর্ধন দক্ষতা খারাপ।

চিত্র 8 ফলাফল এবং ডেটা আউটপুট

পরীক্ষামূলক প্রক্রিয়া:
আরএনএ মানের প্রয়োজনীয়তা:
বিশুদ্ধতা:1.72.0 ইঙ্গিত করে যে অবশিষ্ট আইসোথিওসায়ানেট থাকতে পারে।ক্লিন নিউক্লিক অ্যাসিড A260/A230 2 এর কাছাকাছি হওয়া উচিত .যদি 230 nm এ একটি শক্তিশালী শোষণ থাকে তবে এটি নির্দেশ করে যে ফেনেট আয়নগুলির মতো জৈব যৌগ রয়েছে।উপরন্তু, এটি 1.5% অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা সনাক্ত করা যেতে পারে।মার্কারটি নির্দেশ করুন, কারণ ssRNA এর কোন বিকৃতকরণ নেই এবং আণবিক ওজন লগারিদমের একটি রৈখিক সম্পর্ক নেই এবং আণবিক ওজন সঠিকভাবে প্রকাশ করা যায় না।একাগ্রতা: তাত্ত্বিকভাবেনা100ng/ul এর কম, যদি ঘনত্ব খুব কম হয়, বিশুদ্ধতা সাধারণত কম লম্বা হয় না

Fig9 RNA জেল

উপরন্তু, যদি নমুনাটি মূল্যবান হয় এবং RNA ঘনত্ব বেশি হয়, তাহলে এটি নিষ্কাশনের পরে এটিকে অ্যালিকোট করার পরামর্শ দেওয়া হয় এবং বিপরীত প্রতিলিপির জন্য RNA কে 100-300ng/ul-এর চূড়ান্ত ঘনত্বে পাতলা করার পরামর্শ দেওয়া হয়।ভিতরেবিপরীত প্রতিলিপি প্রক্রিয়া, যখন mRNA প্রতিলিপি করা হয়, oligo (dt) প্রাইমারগুলি যেগুলি বিশেষভাবে polyA টেলের সাথে আবদ্ধ হতে পারে সেগুলি বিপরীত ট্রান্সক্রিপশনের জন্য ব্যবহৃত হয়, যখন lncRNA এবং circRNA মোট RNA-এর বিপরীত ট্রান্সক্রিপশনের জন্য র্যান্ডম হেক্সামার (Random 6 mer) প্রাইমার ব্যবহার করে miRNA-এর জন্য, miRNA-নির্দিষ্ট ট্রান্সক্রিপশনের জন্য miRNA-নির্দিষ্ট প্রাইমার ব্যবহার করা হয়।অনেক কোম্পানি এখন বিশেষ টেলিং কিট চালু করেছে।স্টেম-লুপ পদ্ধতির জন্য, টেইলিং পদ্ধতিটি আরও সুবিধাজনক, উচ্চ-থ্রুপুট এবং বিকারক-সংরক্ষণকারী, কিন্তু একই পরিবারের miRNA গুলিকে আলাদা করার প্রভাব স্টেম-লুপ পদ্ধতির মতো ভাল হওয়া উচিত নয়।প্রতিটি বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন কিটে জিন-নির্দিষ্ট প্রাইমারের (স্টেম-লুপ) ঘনত্বের প্রয়োজনীয়তা রয়েছে।miRNA-এর জন্য ব্যবহৃত অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স হল U6।স্টেম-লুপ ইনভার্সন প্রক্রিয়ায়, U6 এর একটি টিউব আলাদাভাবে উল্টাতে হবে এবং U6 এর সামনের এবং পিছনের প্রাইমারগুলি সরাসরি যুক্ত করতে হবে।সার্কআরএনএ এবং এলএনসিআরএনএ উভয়ই অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স হিসাবে এইচকেজি ব্যবহার করতে পারে।ভিতরেসিডিএনএ সনাক্তকরণ,
আরএনএ-তে কোনো সমস্যা না থাকলে, সিডিএনএও ঠিক থাকতে হবে।যাইহোক, যদি পরীক্ষার পরিপূর্ণতা অনুসরণ করা হয়, তাহলে একটি অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিন (রেফারেন্স জিন, আরজি) ব্যবহার করা ভাল যেটি সিডিএস থেকে জিডিএনএকে আলাদা করতে পারে।সাধারণত, আরজি একটি গৃহস্থালি জিন।, HKG) যেমন চিত্র 10 এ দেখানো হয়েছে;সেই সময়ে, আমি সয়াবিন স্টোরেজ প্রোটিন তৈরি করছিলাম, এবং অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স হিসাবে ইন্ট্রোন ধারণকারী actin7 ব্যবহার করছিলাম।জিডিএনএ-তে এই প্রাইমারের পরিবর্ধিত খণ্ডের আকার ছিল 452bp, এবং যদি cDNA একটি টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহার করা হয় তবে এটি ছিল 142bp।তারপর পরীক্ষার ফলাফলে দেখা গেছে যে cDNA-এর অংশ আসলে gDNA দ্বারা দূষিত ছিল, এবং এটিও প্রমাণ করে যে বিপরীত ট্রান্সক্রিপশনের ফলাফলে কোন সমস্যা ছিল না এবং এটি PCR-এর জন্য একটি টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে।সরাসরি সিডিএনএ দিয়ে অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস চালানো অকেজো, এবং এটি একটি বিচ্ছুরিত ব্যান্ড, যা বিশ্বাসযোগ্য নয়।

চিত্র 10 সিডিএনএ সনাক্তকরণ

qPCR শর্ত নির্ধারণসাধারণত কিটের প্রোটোকল অনুযায়ী কোন সমস্যা হয় না, প্রধানত tm মানের ধাপে।প্রাইমার ডিজাইনের সময় যদি কিছু প্রাইমার ভালভাবে ডিজাইন করা না হয়, যার ফলে tm মান এবং তাত্ত্বিক 60°C এর মধ্যে একটি বড় পার্থক্য দেখা দেয়, তাহলে এটি সুপারিশ করা হয় যে cDNA নমুনাগুলি মিশ্রিত হওয়ার পরে, প্রাইমারগুলির সাথে একটি গ্রেডিয়েন্ট পিসিআর চালান এবং TM মান হিসাবে ব্যান্ড ছাড়া তাপমাত্রা সেট করা এড়াতে চেষ্টা করুন৷

তথ্য বিশ্লেষণ

প্রচলিত আপেক্ষিক ফ্লুরোসেন্স পরিমাণগত পিসিআর প্রক্রিয়াকরণ পদ্ধতি মূলত 2 অনুযায়ী-ΔΔCT.ডেটা প্রসেসিং টেমপ্লেট।

সংশ্লিষ্ট পণ্য:

রিয়েল টাইম পিসিআর সহজ^TM -তাকমান

রিয়েল টাইম পিসিআর সহজ^TM -সাইব্র গ্রীন আই

RT Easy I (প্রথম স্ট্র্যান্ড সিডিএনএ সংশ্লেষণের জন্য মাস্টার প্রিমিক্স)

RT Easy II (qPCR-এর জন্য প্রথম স্ট্র্যান্ড cDNA সংশ্লেষণের জন্য মাস্টার প্রিমিক্স)