পিসিআর, একাধিক পিসিআর, সিটু পিসিআরে, বিপরীত পিসিআর, আরটি-পিসিআর, qPCR (1)-পিসিআর

আমরা বিভিন্ন PCR-এর ধারণা, পদক্ষেপ এবং বিশদ বিবরণগুলি সাজাব

Ⅰ. পিসিআর

পলিমারেজ চেইন রিঅ্যাকশন, যাকে পিসিআর বলা হয়, একটি আণবিক জৈবিক প্রযুক্তি যা নির্দিষ্ট ডিএনএ খণ্ডকে বড় করতে ব্যবহৃত হয়।এটি ভিট্রোতে একটি বিশেষ ডিএনএ প্রতিলিপি হিসাবে গণ্য করা যেতে পারে।ডিএনএ পলিমারেজ (ডিএনএ পলিমারেজ I) 1955 সালের প্রথম দিকে আবিষ্কৃত হয়েছিল, এবং ই. কোলির ক্লেনো ফ্র্যাগমেন্ট, যার পরীক্ষামূলক মূল্য এবং ব্যবহারিকতা রয়েছে, 1970-এর দশকের গোড়ার দিকে ড. এইচ. ক্লেনো আবিষ্কার করেছিলেন, কিন্তু যেহেতু এই এনজাইম তাপমাত্রা সহ্য করে না, তাই উচ্চ তাপমাত্রা পলিমারেজের উচ্চ প্রতিক্রিয়ার সাথে এটিকে ডিজেনারেট করতে পারে না।বর্তমানে ব্যবহৃত এনজাইমগুলি (যাকে Taq পলিমারেজ বলা হয়), 1976 সালে থার্মাস অ্যাকুয়াটিকাস, একটি উষ্ণ বসন্ত ব্যাকটেরিয়া থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। এর বৈশিষ্ট্য হল যে এটি উচ্চ তাপমাত্রাকে প্রতিরোধ করতে পারে এবং এটি একটি আদর্শ এনজাইম, তবে এটি 1980 এর দশকের পরে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়।পিসিআর-এর আসল আদিম প্রোটোটাইপের মূল ধারণাটি জিন মেরামত এবং অনুলিপির অনুরূপ, যা 1971 সালে ডাঃ কেজেল ক্লেপ্পে প্রস্তাব করেছিলেন। তিনি প্রথম সহজ এবং স্বল্প-মেয়াদী জিনের অনুলিপি প্রকাশ করেছিলেন (পিসিআর-এর প্রথম দুটি চক্র প্রতিক্রিয়ার অনুরূপ)।আজকের পিসিআরটি 1983 সালে ডক্টর ক্যারি বি. মুলিস দ্বারা বিকশিত হয়েছিল। ড. মুলিস সেই বছর পিই কোম্পানিগুলিতে সেবা করেছিলেন, তাই পিসিআর শিল্পে PE-এর একটি বিশেষ মর্যাদা রয়েছে।ডাঃ মুলিস 1985 সালে সাইকি এবং অন্যান্যদের সাথে আনুষ্ঠানিকভাবে প্রথম সম্পর্কিত গবেষণাপত্র প্রকাশ করেন। তখন থেকে, পিসিআর-এর ব্যবহার দিনে হাজার হাজার মাইল, এবং সম্পর্কিত কাগজগুলির গুণমান আরও অনেক গবেষণা পদ্ধতিকে অস্বস্তিকর করে তোলে বলা যেতে পারে।পরবর্তীকালে, পিসিআর প্রযুক্তি জৈবিক বৈজ্ঞানিক গবেষণা এবং ক্লিনিকাল অ্যাপ্লিকেশনগুলিতে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়, যা আণবিক জীববিজ্ঞান গবেষণার সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ প্রযুক্তিতে পরিণত হয়।মুলিস 1993 সালে রসায়নে নোবেল পুরস্কারও জিতেছিলেন।

পিসিআরনীতি

পিসিআর প্রযুক্তির মূল নীতিটি ডিএনএ-র প্রাকৃতিক প্রতিলিপি প্রক্রিয়ার অনুরূপ, এবং এর নির্দিষ্টতা অলিগোনিউক্লিওটাইড প্রাইমারের উপর নির্ভর করে যা লক্ষ্য ক্রমের উভয় প্রান্তের পরিপূরক।পিসিআর অবক্ষয়-অ্যানিলিং-প্রসারিত তিনটি মৌলিক বিক্রিয়া ধাপের সমন্বয়ে গঠিত: ①টেমপ্লেট ডিএনএ-এর অবক্ষয়: টেমপ্লেট ডিএনএ একটি নির্দিষ্ট সময়ের জন্য প্রায় 93 ডিগ্রি সেলসিয়াসে উত্তপ্ত হওয়ার পরে, টেমপ্লেটের পিসিআর পরিবর্ধন দ্বারা গঠিত ডুয়েল-চেইন ডিএনএ-এর জন্য দ্বৈত ডিএনএ দ্রবণ তৈরি হয়, যাতে টেমপ্লেটের সাথে এটিকে একক ডিএনএ তৈরি করতে পারে। পরবর্তী রাউন্ড প্রতিক্রিয়া।②টেমপ্লেট ডিএনএ এবং প্রাইমারের অ্যানিলিং (যৌগ): টেমপ্লেট ডিএনএ উত্তপ্ত এবং একটি একক চেইনে অবক্ষয় হওয়ার পরে, তাপমাত্রা প্রায় 55 ডিগ্রি সেলসিয়াসে নেমে আসে।প্রাইমারের পরিপূরক ক্রম এবং টেমপ্লেট DNA একক-চেইন।③প্রাইমারের এক্সটেনশন: ডিএনএ টেমপ্লেট-প্রাইমার বাইন্ডিং টাকডিএনএ পলিমারেজের কর্মের উপর ভিত্তি করে, প্রতিক্রিয়া কাঁচামাল হিসাবে dNTP সহ।প্রতিলিপির নীতি বজায় রাখুন, একটি নতুন আধা-সংরক্ষিত কপি চেইন সংশ্লেষ করুন যা টেমপ্লেট ডিএনএ চেইনের পরিপূরক, এবং পুনরাবৃত্তি চক্রের অবক্ষয়-অ্যানেলিং-এক্সটেনশন তিনটি প্রক্রিয়া আরও "আধা-সংরক্ষিত কপি চেইন" পেতে পারে, এবং এই নতুন চেইনটি আবার উপলব্ধ হবে পরবর্তী চক্রের জন্য একটি টেমপ্লেট হয়ে উঠুন।লুপটি সম্পূর্ণ করতে 2-4 মিনিট সময় লাগে, টার্গেট জিনটি 2-3 ঘন্টার মধ্যে কয়েক মিলিয়ন বার প্রসারিত করা যেতে পারে।

স্ট্যান্ডার্ডপিসিআরপ্রতিক্রিয়া সিস্টেম

পিসিআর প্রতিক্রিয়ার পাঁচটি উপাদান

PCR বিক্রিয়ায় প্রধানত পাঁচ ধরনের পদার্থ জড়িত, যথা প্রাইমার, এনজাইম, dNTP, টেমপ্লেট এবং বাফার (Mg2+ প্রয়োজন)।[পিসিআর পদ্ধতি]

স্ট্যান্ডার্ড পিসিআর প্রক্রিয়া তিনটি ধাপে বিভক্ত

1. ডিএনএ অবক্ষয় (90°C-96°C): তাপীয় ক্রিয়ায় ডুয়াল-চেইন ডিএনএ টেমপ্লেট, হাইড্রোজেন বন্ধন ভেঙে যায়, একটি একক-চেইন ডিএনএ গঠন করে।

2. অ্যানিলিং (25℃ -65℃): সিস্টেমের তাপমাত্রা হ্রাস করা হয়, প্রাইমারকে DNA টেমপ্লেটের সাথে একত্রিত করে একটি স্থানীয় দ্বৈত-চেইন তৈরি করা হয়।

3. এক্সটেনশন (70℃ -75℃): Taq এনজাইমের (প্রায় 72°C, সর্বোত্তম কার্যকলাপ) ক্রিয়াকলাপের অধীনে, dNTP কাঁচামাল হিসাবে ব্যবহৃত হয়, প্রাইমারের 5′ প্রান্ত থেকে → 3′ প্রান্ত পর্যন্ত প্রসারিত হয়, সংশ্লেষণ এবং টেমপ্লেট একে অপরের DNA চেইনের পরিপূরক।

প্রতিটি চক্র ডিএনএ বিষয়বস্তু দ্বিগুণ, বিকৃত, annealed এবং প্রসারিত হয়.বর্তমানে, সংক্ষিপ্ত পরিবর্ধন অঞ্চলের কারণে, Taq এনজাইমের ক্রিয়াকলাপ সর্বোত্তম না হলেও খুব অল্প সময়ের মধ্যে কিছু PCR প্রতিলিপি করা যেতে পারে, তাই এটি দুটি ধাপে পরিবর্তন করা যেতে পারে, অর্থাৎ, অ্যানিলিং এবং এক্সটেনশন একই সময়ে 60°C-65°C এ সঞ্চালিত হতে পারে।উত্তোলন এবং ঠান্ডা করার প্রক্রিয়া কমাতে এবং প্রতিক্রিয়া গতি উন্নত করার জন্য।

পিসিআর প্রতিক্রিয়া বৈশিষ্ট্য

● উচ্চ-নির্দিষ্টতা

পিসিআর প্রতিক্রিয়ার নির্দিষ্ট নির্ধারক কারণগুলি হল: ① প্রাইমার এবং টেমপ্লেট ডিএনএর নির্দিষ্ট সংমিশ্রণ।②বেস পেয়ারিংয়ের নীতি।③ TaqDNA পলিমারেজ সংশ্লেষণ প্রতিক্রিয়ার আনুগত্য।④ টার্গেট জিনের নির্দিষ্টতা এবং রক্ষণশীলতা।

প্রাইমার এবং টেমপ্লেটের সঠিক সংমিশ্রণই হল মূল চাবিকাঠি।প্রাইমার এবং টেমপ্লেটের বাঁধাই এবং প্রাইমার চেইনের এক্সটেনশন ক্ষারীয় বেস মিলের নীতির উপর ভিত্তি করে।পলিমারেজ সংশ্লেষণ বিক্রিয়ার আনুগত্য এবং বিক্রিয়ায় টেমপ্লেট এবং প্রাইমারের বাঁধাই (যৌগ) করার জন্য Taq DNA পলিমারেজের উচ্চ তাপমাত্রা প্রতিরোধের উচ্চ তাপমাত্রায় সঞ্চালিত হতে পারে।সংমিশ্রণের নির্দিষ্টতা ব্যাপকভাবে বৃদ্ধি করা হয়।ক্লিপ সঠিকতা একটি উচ্চ ডিগ্রী বজায় রাখতে পারেন.উচ্চ রক্ষণশীলতা এবং উচ্চ রক্ষণশীলতা সহ একটি লক্ষ্য জেনেটিক অঞ্চল নির্বাচন করে, এর নির্দিষ্টতা উচ্চতর হয়।

● উচ্চ সংবেদনশীলতা

পিসিআর পণ্যগুলির উত্পাদনের পরিমাণ সূচক দ্বারা বৃদ্ধি করা হয়, যা মাইক্রোকন্ট্রোলারের স্তরকে মাইক্রোগ্রামের স্তরে (μg= -6) বৃদ্ধি করতে পিকার (PG=10-12) এর শুরুর টেমপ্লেটকে প্রসারিত করতে পারে।1 মিলিয়ন কোষ থেকে একটি লক্ষ্য কোষ সনাক্ত করা যেতে পারে;ভাইরাস সনাক্তকরণে, পিসিআর-এর সংবেদনশীলতা 3টি আরএফইউতে পৌঁছাতে পারে (খালি দাগ গঠিত ইউনিট);ব্যাকটেরিয়া বিজ্ঞানে সর্বনিম্ন সনাক্তকরণের হার হল 3 ব্যাকটেরিয়া।

● সহজ এবং দ্রুত

পিসিআর প্রতিফলন একটি উচ্চ-তাপমাত্রা Taq ডিএনএ পলিমারেজ ব্যবহার করে, যা এক সময়ে প্রতিক্রিয়া সমাধান যোগ করে, অর্থাৎ, ডিএনএ পরিবর্ধন সমাধান এবং জল স্নানের পাত্রে একটি অবক্ষয়-অ্যানিয়াল-এক্সটেনশন প্রতিক্রিয়া।সাধারণত, পরিবর্ধন প্রতিক্রিয়া 2 থেকে 4 ঘন্টার মধ্যে সম্পন্ন হয়।বর্ধিত পণ্যগুলি সাধারণত বৈদ্যুতিক তলোয়ার দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়, এবং আইসোটোপ ব্যবহার করতে হবে না, কোন তেজস্ক্রিয় দূষণ নেই এবং সহজ প্রচার।

● নমুনার বিশুদ্ধতা কম

ভাইরাস বা ব্যাকটেরিয়া এবং কালচার সেল আলাদা করার দরকার নেই।ডিএনএ অশোধিত পণ্য এবং আরএনএ পরিবর্ধক হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে।রক্ত, শরীরের তরল, কাশি ধোয়ার তরল, চুল, কোষ এবং জীবন্ত টিস্যুর মতো ক্লিনিকাল নমুনা ব্যবহার করে ডিএনএ পরিবর্ধন সনাক্তকরণ সরাসরি ব্যবহার করা যেতে পারে।

পিসিআরসাধারন সমস্যা

● মিথ্যা নেতিবাচক, কোনো পরিবর্ধিত ব্যান্ড নেই

পিসিআর প্রতিক্রিয়ার মূল ধাপগুলির মধ্যে রয়েছে: ① টেমপ্লেট নিউক্লিক অ্যাসিডের প্রস্তুতি, ② গুণমান এবং প্রাইমারের নির্দিষ্টতা, ③ এনজাইমের গুণমান ④ পিসিআর চক্রের অবস্থা।কারণ খোঁজার উপরোক্ত লিঙ্কগুলির জন্য বিশ্লেষণ এবং অধ্যয়ন করা উচিত।

টেমপ্লেট: ① টেমপ্লেটে বিবিধ প্রোটিন রয়েছে, ② টেমপ্লেটটিতে একটি Taq এনজাইম ইনহিবিটর রয়েছে, ③ টেমপ্লেটের প্রোটিন বাদ দেওয়া হয় না, বিশেষ করে ক্রোমোজোমের গ্রুপ প্রোটিন।⑤ ডেমিনার নিউক্লিক অ্যাসিডের অবক্ষয় পুঙ্খানুপুঙ্খ নয়।যখন এনজাইম এবং প্রাইমারগুলির গুণমান ভাল থাকে, তখন কোনও পরিবর্ধন ব্যান্ড থাকে না, যা সম্ভবত নমুনাগুলির পাচক চিকিত্সা।টেমপ্লেট নিউক্লিক অ্যাসিড নিষ্কাশন প্রক্রিয়ার সাথে কিছু ভুল আছে, তাই একটি কার্যকর এবং স্থিতিশীল হজম সমাধান প্রস্তুত করতে, এর পদ্ধতিটি ঠিক করা উচিত এবং ইচ্ছামত পরিবর্তন করা উচিত নয়।

এনজাইম নিষ্ক্রিয়করণ: একটি নতুন এনজাইম বা পুরানো এবং নতুন উভয় এনজাইম একসাথে ব্যবহার করা উচিত বিশ্লেষণ করার জন্য যে এনজাইমের কার্যকলাপ হারিয়ে গেছে বা অপর্যাপ্ত, যা মিথ্যা নেতিবাচক দিকে পরিচালিত করে।এটা উল্লেখ করা উচিত যে Taq এনজাইম বা ইথিডিয়াম ব্রোমাইড কখনও কখনও ভুলে যায়।

প্রাইমার: প্রাইমারের গুণমান, প্রাইমারের ঘনত্ব এবং দুটি প্রাইমারের ঘনত্ব প্রতিসম কিনা।এটি PCR ব্যর্থতার একটি সাধারণ কারণ বা ক্রমবর্ধমান ব্যান্ড আদর্শ নয় এবং ছড়িয়ে পড়ার প্রবণতা।কিছু ব্যাচ নম্বরের প্রাইমারের মান নিয়ে সমস্যা রয়েছে।দুটি প্রাইমারের উচ্চ ঘনত্ব এবং কম ঘনত্ব রয়েছে, যার ফলে কম-দক্ষতা অসমমিতিক পরিবর্ধন হয়।পাল্টা ব্যবস্থা হল: ① ইউনিট সংশ্লেষ করার জন্য একটি ভাল প্রাইমার নির্বাচন করুন।② প্রাইমারের ঘনত্ব শুধুমাত্র OD মানের উপর নির্ভর করে না, তবে আগর সুগার জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস করতে প্রাইমারের আসল তরলের দিকেও মনোযোগ দেয়।একটি প্রাইমার স্ট্রিপ জোন থাকতে হবে, এবং দুটি প্রাইমারের উজ্জ্বলতা সাধারণত সামঞ্জস্যপূর্ণ হওয়া উচিত।বেল্ট, পিসিআর এই সময়ে ব্যর্থ হতে পারে, এবং এটি প্রাইমার সংশ্লেষণ ইউনিট দিয়ে সমাধান করা উচিত।একটি প্রাইমার বেশি হলে, উজ্জ্বলতা কম, এবং পাতলা করার সময় এর ঘনত্ব অবশ্যই ভারসাম্যপূর্ণ হতে হবে।③ রেফ্রিজারেটরের একাধিক জমা বা দীর্ঘমেয়াদী রেফ্রিজারেশন যন্ত্রাংশ রোধ করতে প্রাইমারটিকে উচ্চ ঘনত্বে অর্থ প্রদান করা উচিত এবং সংরক্ষণ করা উচিত, যা প্রাইমারের অবনতি এবং অবনতি ঘটাবে।④ প্রাইমারের নকশা অযৌক্তিক, যেমন প্রাইমারের দৈর্ঘ্য অপর্যাপ্ত, এবং প্রাইমারগুলির মধ্যে ডি ক্লাস্টার তৈরি হয়।

Mg2+ঘনত্ব: Mg2+আয়ন ঘনত্ব পিসিআর পরিবর্ধন দক্ষতার উপর দারুণ প্রভাব ফেলে।অত্যধিক ঘনত্ব পিসিআর পরিবর্ধনের বিপরীত লিঙ্গকে হ্রাস করতে পারে।ঘনত্ব খুব কম হলে, পিসিআর পরিবর্ধন আউটপুট এমনকি প্রসারণ ব্যান্ড ছাড়াই পিসিআর পরিবর্ধন ব্যর্থতা তৈরি করবে।

প্রতিক্রিয়া ভলিউম পরিবর্তন: PCR পরিবর্ধনে ব্যবহৃত ভলিউম হল 20ul, 30ul, এবং 50ul বা 100uL, PCR পরিবর্ধনের জন্য আবেদনের বৃহৎ আয়তন বৈজ্ঞানিক গবেষণা এবং ক্লিনিকাল পরীক্ষার বিভিন্ন উদ্দেশ্য অনুসারে সেট করা হয়েছে।ছোট ভলিউম যেমন 20ul তৈরি করার পরে, আকার তৈরি করার সময় একটি কর্ড অবস্থা তৈরি করা প্রয়োজন, অন্যথায় এটি ব্যর্থ হবে।

শারীরিক কারণ: পিসিআর পরিবর্ধনের জন্য রূপান্তর খুবই গুরুত্বপূর্ণ।যদি অবক্ষয় তাপমাত্রা কম হয়, অবক্ষয় সময় কম হয়, এটি মিথ্যা নেতিবাচক হওয়ার সম্ভাবনা থাকে;খুব কম অ্যানিলিং তাপমাত্রা অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনের কারণ হতে পারে এবং নির্দিষ্ট পরিবর্ধন দক্ষতা হ্রাস করতে পারে।PCR পরিবর্ধন দক্ষতা কমাতে প্রাইমার এবং টেমপ্লেটগুলির সংমিশ্রণকে অত্যন্ত প্রভাবিত করে।কখনও কখনও এক্সটেনশন বা জল-দ্রবণীয় কুকারের পরিবর্তনশীলতা, অ্যানিলিং এবং বর্ধিত তাপমাত্রা সনাক্ত করতে স্ট্যান্ডার্ড থার্মোমিটার ব্যবহার করা প্রয়োজন, যা পিসিআর ব্যর্থতার অন্যতম কারণ।

টার্গেট সিকোয়েন্স ভেরিয়েন্ট: যদি টার্গেট সিকোয়েন্স ঘটে, মিউটেশন বা ডিলিট করা হয়, প্রোটোটাইপ এবং টেমপ্লেটের কম্বিনেশন একত্রিত হয়, অথবা টার্গেট সিকোয়েন্স না থাকার কারণে প্রাইমার এবং টেমপ্লেট পরিপূরক সিকোয়েন্স হারাবে এবং এর PCR অ্যামপ্লিফিকেশন সফল হবে না।

● মিথ্যা ইতিবাচক

PCR পরিবর্ধন ব্যান্ড টার্গেট সিকোয়েন্স ব্যান্ডের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ দেখায় এবং কখনও কখনও এর ব্যান্ড আরও ঝরঝরে এবং উচ্চতর হয়।

প্রাইমার ডিজাইন উপযুক্ত নয়: নির্বাচিত পরিবর্ধন ক্রম এবং অ-উদ্দেশ্য পরিবর্ধন ক্রম সমজাতীয় থাকে, তাই যখন PCR পরিবর্ধন, পরিবর্ধিত PCR পণ্যগুলি উদ্দেশ্যহীন ক্রম।লক্ষ্য ক্রমটি খুব ছোট বা প্রাইমারটি খুব ছোট, এবং এটি মিথ্যা পজিটিভ প্রবণ।নতুন করে ডিজাইন করা দরকার।

লক্ষ্য ক্রম বা পরিবর্ধন পণ্যগুলির ক্রস দূষণ: এই দূষণের দুটি কারণ রয়েছে: প্রথমত, সমগ্র জিনোম বা বড় অংশগুলির ক্রস-দূষণ, যা মিথ্যা ইতিবাচক দিকে পরিচালিত করে।এই ধরনের মিথ্যা ইতিবাচক নিম্নলিখিত পদ্ধতিগুলির দ্বারা সমাধান করা যেতে পারে: স্যাম্পল বন্দুকের মধ্যে শ্বাস নেওয়া বা কেন্দ্রাতিগ টিউব থেকে স্প্ল্যাশ থেকে লক্ষ্য ক্রম প্রতিরোধ করার জন্য অপারেশনের সময় সতর্কতা অবলম্বন করুন।উচ্চ তাপমাত্রা সহ্য করতে পারে না এমন এনজাইম এবং পদার্থ ব্যতীত, সমস্ত বিকারক বা সরঞ্জাম উচ্চ চাপ দিয়ে জীবাণুমুক্ত করা উচিত।কেন্দ্রাতিগ পাইপ এবং নমুনা এক সময়ে ব্যবহার করা উচিত.যখন প্রয়োজন হয়, নমুনা যোগ করার আগে, প্রতিক্রিয়া টিউব এবং বিকারক বিদ্যমান নিউক্লিক অ্যাসিড ধ্বংস করার জন্য অতিবেগুনী রশ্মির সংস্পর্শে আসে।দ্বিতীয়ত, বায়ু দূষণে ছোট ছোট অংশ।এই ছোট খণ্ডগুলো লক্ষ্য ক্রম থেকে ছোট, কিন্তু তাদের নির্দিষ্ট সমতা আছে।এটা একে অপরের সঙ্গে spliced ​​করা যেতে পারে.প্রাইমারগুলি পরিপূরক করার পরে, পিসিআর পণ্যটি প্রসারিত করা যেতে পারে, যা মিথ্যা ইতিবাচক উত্পাদনের কারণ হবে।এটি নেস্ট পিসিআর পদ্ধতি কমাতে বা নির্মূল করতে ব্যবহার করা যেতে পারে।

● অনির্দিষ্ট পরিবর্ধন ব্যান্ড প্রদর্শিত

পিসিআর পরিবর্ধনের পরে উপস্থিত হওয়া ব্যান্ডগুলি প্রত্যাশিত আকারের সাথে অসামঞ্জস্যপূর্ণ, বা বড় বা ছোট, বা একই সময়ে, বা একই সময়ে, নির্দিষ্ট পরিবর্ধন ব্যান্ড এবং অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন ব্যান্ড।অ-নির্দিষ্ট ব্যান্ডগুলির উত্থান হল: প্রথমত, প্রাইমারগুলি লক্ষ্য ক্রমের অসম্পূর্ণ পরিপূরক, অথবা একটি ডি ক্লাস্টার গঠনের জন্য প্রাইমারের পলিমারাইজেশন।দ্বিতীয়টি হল যে MG2+আয়নগুলির ঘনত্ব খুব বেশি, অ্যানিলিং তাপমাত্রা খুব কম এবং পিসিআর চক্রের সংখ্যা সম্পর্কিত।দ্বিতীয়ত, এনজাইমের গুণমান এবং পরিমাণ।প্রায়শই, কিছু উত্সের এনজাইমগুলি অ-বিশেষ ব্যান্ডের প্রবণ হয় এবং অন্য উত্সের এনজাইমগুলি ঘটে না।কখনও কখনও এনজাইমগুলির অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনও ঘটে।পাল্টা ব্যবস্থাগুলি হল: প্রয়োজনে আকর্ষণীয় পুনরায় ডিজাইন করা।এনজাইমের পরিমাণ হ্রাস করুন বা অন্য উত্সের এনজাইম প্রতিস্থাপন করুন।প্রাথমিকের পরিমাণ হ্রাস করুন, যথাযথভাবে টেমপ্লেটের পরিমাণ বাড়ান এবং চক্রের সংখ্যা হ্রাস করুন।অ্যানিলিং তাপমাত্রা সঠিকভাবে বৃদ্ধি করুন বা দুটি তাপমাত্রা বিন্দু পদ্ধতি ব্যবহার করুন (93 ডিগ্রি সেলসিয়াস অবক্ষয়, অ্যানিলিং এবং প্রায় 65 ডিগ্রি সেলসিয়াসে প্রসারিত)।

● ফ্ল্যাকি টো বা স্মিয়ার টেপ দেখায়

পিসিআর পরিবর্ধন কখনও কখনও প্রয়োগ করা বা খোসা বা কার্পেটের মতো বেল্ট বলে মনে হয়।এই কারণে, এনজাইমের অত্যধিক পরিমাণ বা এনজাইমের নিম্নমানের কারণে, dNTP ঘনত্ব খুব বেশি, Mg2+ ঘনত্ব খুব বেশি, অ্যানিলিং তাপমাত্রা খুব কম এবং চক্রের সংখ্যা খুব বেশি।পাল্টা ব্যবস্থাগুলি হল: ①এনজাইমের পরিমাণ হ্রাস করুন বা অন্য উত্সের এনজাইম পরিবর্তন করুন।②dNTP এর ঘনত্ব হ্রাস করুন ③সঠিকভাবে Mg2+ ঘনত্ব হ্রাস করুন।④টেমপ্লেটের পরিমাণ বাড়ান এবং চক্রের সংখ্যা কমিয়ে দিন।

সংশ্লিষ্ট পণ্য

PCR Heroᵀᴹ (ডাই দিয়ে)

◮ উচ্চতর বিশ্বস্ততা: সাধারণ Taq এনজাইমের 6 গুণ;

◮ দ্রুত পরিবর্ধন গতি

◮ আরও টেমপ্লেট অভিযোজনযোগ্যতা

◮ উচ্চতর পরিবর্ধন দক্ষতা

◮ পরিবেশগত সহনশীলতা শক্তিশালী: এক সপ্তাহের জন্য 37°C তাপমাত্রায় রাখা, 90% এর বেশি কার্যকলাপ বজায় রাখা;

◮ এটিতে 5'→3' ডিএনএ পলিমারেজ কার্যকলাপ এবং 5'→3' এক্সোনিউক্লিজ ক্রিয়াকলাপ রয়েছে, 3'→5' এক্সোনিউক্লিজ কার্যকলাপ ছাড়াই।

PCR Easyᴹ (ডাই দিয়ে)

অনন্য প্রতিক্রিয়া ব্যবস্থা এবং উচ্চ-দক্ষতা Taq DNA পলিমারেজ PCR প্রতিক্রিয়াকে উচ্চতর পরিবর্ধন দক্ষতা, নির্দিষ্টতা এবং সংবেদনশীলতা তৈরি করে।

আরটি-qPCR Easyᵀᴹ (এক ধাপ)-SYBR Green I

◮ ওয়ান-স্টেপ কিট একই টিউবে বিপরীত প্রতিলিপি এবং qPCR দুটি প্রতিক্রিয়া তৈরি করে, শুধুমাত্র টেমপ্লেট RNA, নির্দিষ্ট PCR প্রাইমার এবং RNase-ফ্রি ddH যোগ করতে হবে₂O.

◮ কিটটি দ্রুত এবং দক্ষতার সাথে পরিমাণগতভাবে ভাইরাল RNA বা RNA ট্রেস করতে পারে।

◮ কিটটি একটি অনন্য ফোরজিন রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন রিএজেন্ট এবং ফোরজিন হটস্টার টাক ডিএনএ পলিমারেজ ব্যবহার করে এবং প্রতিক্রিয়াটির পরিবর্ধন দক্ষতা এবং নির্দিষ্টতাকে কার্যকরভাবে উন্নত করতে একটি অনন্য প্রতিক্রিয়া সিস্টেমের সাথে মিলিত হয়।

◮ অপ্টিমাইজ করা প্রতিক্রিয়া সিস্টেম প্রতিক্রিয়াটিকে উচ্চতর সনাক্তকরণ সংবেদনশীলতা, শক্তিশালী তাপীয় স্থিতিশীলতা এবং আরও ভাল সহনশীলতা তৈরি করে।

◮ RT-qPCR সহজ^TM(এক ধাপ)-এসওয়াইবিআর গ্রিন আই কিটটি ROX অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স ডাই সহ আসে, যা সিগন্যাল ব্যাকগ্রাউন্ড এবং কূপের মধ্যে সংকেত ত্রুটিগুলি দূর করতে ব্যবহার করা যেতে পারে, যা গ্রাহকদের পরিমাণগত পিসিআর যন্ত্রের বিভিন্ন মডেলে ব্যবহার করার জন্য সুবিধাজনক।

আরটি সহজ^TM২ (এর জন্য মাস্টার প্রিমিক্স জন্য প্রথম স্ট্র্যান্ড cDNA সংশ্লেষণরিয়েল টাইম পিসিআর)

-জিডিএনএ অপসারণ করার দক্ষ ক্ষমতা, যা 2 মিনিটের মধ্যে টেমপ্লেটে জিডিএনএ অপসারণ করতে পারে।

-দক্ষ বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন সিস্টেম, এটি প্রথম স্ট্র্যান্ড cDNA এর সংশ্লেষণ সম্পূর্ণ করতে মাত্র 15 মিনিট সময় নেয়।

-জটিল টেমপ্লেট: উচ্চ GC বিষয়বস্তু এবং জটিল গৌণ কাঠামো সহ টেমপ্লেটগুলিও উচ্চ দক্ষতার সাথে বিপরীত করা যেতে পারে।

-উচ্চ-সংবেদনশীলতা বিপরীত প্রতিলিপি সিস্টেম, পিজি-স্তরের টেমপ্লেটগুলিও উচ্চ-মানের সিডিএনএ পেতে পারে।

-রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন সিস্টেমের উচ্চ তাপীয় স্থিতিশীলতা রয়েছে, সর্বোত্তম প্রতিক্রিয়া তাপমাত্রা 42℃, এবং এটি এখনও 50℃ এ ভাল বিপরীত প্রতিলিপি কার্যকারিতা রয়েছে।