RT-qPCR হল আণবিক জীববিজ্ঞানের মৌলিক পরীক্ষা, এবং প্রত্যেককে অবশ্যই এটির সাথে পরিচিত হতে হবে।এতে প্রধানত তিনটি ধাপ রয়েছে: আরএনএ নিষ্কাশন, সিডিএনএ-তে বিপরীত প্রতিলিপি এবং রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর।এটা সাহায্য করে না, কি হচ্ছে?এটি একটি সমস্যা আছে যে সম্ভবতবিপরীত প্রতিলিপি পরীক্ষা!যদিও এটা মনে হয় যে বিপরীত প্রতিলিপি পরীক্ষা শুধুমাত্র RNA, dNTP, প্রাইমার এবং যোগ করতে হবেবিপরীত প্রতিলিপিসেন্ট্রিফিউজ টিউব এবং ভালভাবে মিশ্রিত করুন, কিন্তু প্রকৃত অপারেশন প্রক্রিয়ায়, এখনও অনেক বিবরণ আছে যেগুলিতে মনোযোগ দিতে হবে।আসুন এটি সম্পর্কে শিখি!

আরএনএর গুণমান কীভাবে বিচার করবেন?
সিডিএনএ পাওয়ার জন্য, আরএনএ-র গুণমান গুরুত্বপূর্ণ!আরএনএ গুণমান প্রধানত দুটি দিক থেকে সনাক্ত করা যেতে পারে:
(1) আরএনএ অখণ্ডতা:আরএনএ অখণ্ডতা অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা যাচাই করা যেতে পারে. ইউক্যারিওটসকে উদাহরণ হিসেবে নিলে, সম্পূর্ণ মোট RNA-তে তিনটি স্পষ্ট ব্যান্ড রয়েছে, বড় থেকে ছোট পর্যন্ত আণবিক ওজন হল 28S, 18S, এবং 5S, এবং 28S 18S এর দ্বিগুণ উজ্জ্বল;যদি তিনটি ব্যান্ড দেখা যায়, কিন্তু ব্যান্ডের ধরন ঝাপসা বা ডিফিউশন মানে RNA আংশিকভাবে অবনমিত।এই সময়ে, অনুগ্রহ করে অবিলম্বে বিপরীত প্রতিলিপি প্রতিক্রিয়া সঞ্চালন করুন এবং যথাযথভাবে টেমপ্লেট ইনপুট বাড়ান;যদি শুধুমাত্র একটি ছোট আণবিক ওজনের ব্যান্ড বা কোন ব্যান্ড দেখা না যায়, তাহলে আরএনএ সম্পূর্ণরূপে ক্ষয়প্রাপ্ত হয়েছে এবং পুনরায় নিষ্কাশন করা প্রয়োজন।Agilent 2100 পিক ডায়াগ্রাম এবং RIN মান সহ RNA এর অখণ্ডতা নির্দেশ করে।নিউক্লিক অ্যাসিড অক্ষত থাকলে, ইলেক্ট্রোফেরোগ্রামের ভিত্তিরেখা সমতল হয়;যদি নিউক্লিক অ্যাসিড মারাত্মকভাবে ক্ষয়প্রাপ্ত হয়, তাহলে বেসলাইনটি অসম হয় এবং আরও ক্ষয় শিখর উপস্থিত হয়;RIN-এর মান RNA-এর অখণ্ডতাকে প্রতিফলিত করে, 0-10-এর মধ্যে, মান যত বড় হবে, RNA-এর গুণমান তত ভাল হবে।ভাল, সম্পূর্ণতা উচ্চতর ডিগ্রী.
(2) RNA এর বিশুদ্ধতা:OD260/280 এর অনুপাত UV স্পেকট্রোফটোমেট্রি দ্বারা সনাক্ত করা যেতে পারে।OD260/280 এর অনুপাত 1.9 এবং 2.1 এর মধ্যে হলে, বিশুদ্ধতা খুব ভাল।
অবশিষ্ট জিনোমিক ডিএনএ ভুল পরিমাণগত ফলাফলের দিকে নিয়ে যেতে পারে
যখন আরএনএ বের করা হয়, তখন আমরা যে আরএনএ পাই তা জিনোমিক ডিএনএ (জিডিএনএ) এর সাথে মিশ্রিত হতে পারে যা পরিষ্কার করা হয়নি।অতএব, বিপরীত ট্রান্সক্রিপশনের পরে সিডিএনএও মিশ্রিত হবেজিডিএনএ.ভাটির সময়qPCRপ্রতিক্রিয়া,cDNAএবং gDNA একই সাথে প্রসারিত হতে পারে, যার ফলে তুলনামূলকভাবে ছোট CT মান হয়, তাই ফলাফল পক্ষপাতদুষ্ট হতে পারে।
তাহলে এই পরিস্থিতিতে আমাদের কি করা উচিত?ফরজিনপরামর্শ দেয়:
(1) বিপরীত আরএনএতে জিনোম পরিষ্কার করুন, যা আরএনএ নিষ্কাশনের সময় কলাম নিষ্কাশন দ্বারা সরানো যেতে পারে;
(2) নিষ্কাশিত আরএনএকে DNase দিয়ে চিকিত্সা করুনI , কিন্তু EDTA এর মাধ্যমে এটি বন্ধ করুন;
বিপরীত প্রতিলিপি রিএজেন্টজিনোম ক্লিয়ারিং মডিউল সহ;

বিপরীত প্রতিলিপি জন্য প্রাইমার নির্বাচন কিভাবে?
বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন প্রাইমারগুলি বিপরীত প্রতিলিপি প্রতিক্রিয়ার ফলাফলকেও প্রভাবিত করে।আপনি পরীক্ষার নির্দিষ্ট পরিস্থিতি অনুযায়ী বিপরীত ট্রান্সক্রিপশনের জন্য র্যান্ডম প্রাইমার, অলিগো ডিটি বা জিন-নির্দিষ্ট প্রাইমার বেছে নিতে পারেন:
(1) নির্দিষ্ট প্রতিলিপি: জিন-নির্দিষ্ট প্রাইমার সুপারিশ করা হয়;
(2) দীর্ঘ খণ্ড প্রতিলিপি: Oligo dT/জিন-নির্দিষ্ট প্রাইমার সুপারিশ করা হয়;
(3) দীর্ঘ-সেগমেন্ট ট্রান্সক্রিপ্টের অভ্যন্তরীণ অংশ: জিন-নির্দিষ্ট প্রাইমার/ র্যান্ডম প্রাইমার/ র্যান্ডম প্রাইমার + অলিগো ডিটি।যদি পরবর্তী qPCR পরীক্ষা করা হয়, Oligo dT একা ব্যবহার করা যাবে না, কারণ Oligo dT একা ব্যবহার করলে 3′ শেষ পক্ষপাত হতে পারে, যা ভুল qPCR পরীক্ষার ফলাফলের দিকে পরিচালিত করে;
(4) miRNA: স্টেম-লুপ প্রাইমার বা টেইলিং প্রাইমার ব্যবহার করা যেতে পারে।

পরিমাপের জন্য বিপরীত প্রতিলিপি পণ্য cDNA কতবার পাতলা করা উচিত?
বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন পণ্যের সিডিএনএ পাওয়ার পর, কিউপিসিআর পরীক্ষার জন্য কতবার সিডিএনএ পাতলা করা উচিত তা খুবই গুরুত্বপূর্ণ।সিডিএনএ ঘনত্ব খুব বেশি বা খুব কম হলে, পরিবর্ধন দক্ষতা প্রভাবিত হতে পারে।সিডিএনএ ঘনত্ব পরিমাপ করা যেতে পারে এবং এটি কিভাবে করা উচিত?
(1) বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন পণ্যের cDNA ঘনত্ব পরিমাপ করা যায় না, কারণ cDNA পণ্য ছাড়াও, বিপরীত প্রতিলিপি পণ্যটিতে বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন অবশিষ্ট বাফার, বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজ, প্রাইমার ইত্যাদিও থাকে, যা ঘনত্ব পরিমাপের ফলাফলে হস্তক্ষেপ করবে এবং তাই OD260/280, OD260/280 এবং OD260/280, OD230, abdn236 এবং অ্যাবিডিএনএ ট্রুকে প্রতিফলিত করবে না। ক্ষেত্রএ সময় কয়েকজন বন্ধু বলবে, তাহলে পরিশুদ্ধির পর একাগ্রতা মাপবো;এখানে, ফোরজিন মনে করিয়ে দিতে চাই যে সিডিএনএ শুদ্ধ করার পরামর্শ দেওয়া হয় না, কারণ বিপরীতে প্রাপ্ত সিডিএনএর দৈর্ঘ্য ভিন্ন, এবং সংক্ষিপ্ত সিডিএনএ বিশুদ্ধকরণে হারিয়ে যাবে।
(2) তাহলে কি করতে হবে?qPCR পরীক্ষার আগে, প্রাক-পরীক্ষার মাধ্যমে সিডিএনএর তরল গ্রেডিয়েন্ট নির্ধারণ করা যেতে পারে।উদাহরণস্বরূপ: qPCR পরীক্ষার জন্য টেমপ্লেট হিসাবে cDNA স্টক সলিউশন, 10-গুণ ডাইলিউশন এবং 100-গুণ ডাইলিউশন ব্যবহার করুন এবং 18-28 রেঞ্জের মধ্যে CT মান সহ পাতলা ফ্যাক্টর নির্বাচন করুন।

কিভাবে miRNAs বিপরীত প্রতিলিপি করা উচিত?
miRNA হল প্রায় 22 nt এর আকারের একটি একক-স্ট্র্যান্ডেড ছোট অণু RNA যা প্রোটিনের জন্য কোড করে না।এর দৈর্ঘ্য কম হওয়ার কারণে, প্রচলিত qPCR পদ্ধতিতে এটিকে সরাসরি পরিমাপ করা কঠিন, তাই প্রায়ই miRNA প্রসারিত করা প্রয়োজন হয়;miRNA-এর জন্য সাধারণত ব্যবহৃত বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন পদ্ধতিগুলির মধ্যে রয়েছে স্টেম-লুপ পদ্ধতি এবং টেলিং পদ্ধতি।
স্টেম-লুপ পদ্ধতি হল স্টেম-লুপ প্রাইমার যোগ করে miRNA প্রসারিত করা।এই সনাক্তকরণ পদ্ধতির উচ্চ সংবেদনশীলতা এবং নির্দিষ্টতা রয়েছে, তবে সনাক্তকরণ থ্রুপুট কম।একটি বিপরীত প্রতিলিপি শুধুমাত্র একটি miRNA এবং একটি অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স সনাক্ত করতে পারে;লেজ-সংযোজন পদ্ধতিটি দুটি দ্বারা গঠিত এটি দুটি এনজাইমের যৌথ ক্রিয়া দ্বারা সম্পন্ন হয়, যেগুলি হল পলিএ পলিমারেজ এবং বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজ।PolyA পলিমারেজ তার দৈর্ঘ্য বাড়াতে miRNA-তে PolyA লেজ যোগ করার জন্য দায়ী, এবং বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজ বিপরীত প্রতিলিপি প্রতিক্রিয়া সম্পাদন করে।এই পদ্ধতিতে উচ্চ সনাক্তকরণ থ্রুপুট রয়েছে এবং এটি একটি বিপরীত প্রতিলিপিতে একাধিক miRNA এবং অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স সনাক্ত করতে পারে, তবে স্টেম-লুপ পদ্ধতিতে সংবেদনশীলতা এবং নির্দিষ্টতা কম।