রিয়েল টাইম পিসিআর, যা পরিমাণগত পিসিআর বা কিউপিসিআর নামেও পরিচিত, এটি পিসিআর পরিবর্ধন পণ্যগুলির রিয়েল-টাইম পর্যবেক্ষণ এবং বিশ্লেষণের একটি পদ্ধতি।
কারণ পরিমাণগত পিসিআর-এর সহজ অপারেশন, দ্রুত এবং সুবিধাজনক, উচ্চ সংবেদনশীলতা, ভাল পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা এবং কম দূষণের হারের সুবিধা রয়েছে, এটি চিকিৎসা পরীক্ষা, ওষুধের কার্যকারিতা মূল্যায়ন, জিন এক্সপ্রেশন গবেষণা, ট্রান্সজেনিক গবেষণা, জিন সনাক্তকরণ, প্যাথোজেন সনাক্তকরণ, প্রাণী ও উদ্ভিদ সনাক্তকরণে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়।, খাদ্য পরীক্ষা এবং অন্যান্য ক্ষেত্র.
অতএব, আপনি জীবন বিজ্ঞানের মৌলিক গবেষণায় নিয়োজিত হন বা ফার্মাসিউটিক্যাল কোম্পানির কর্মচারী, পশুপালন কোম্পানি, খাদ্য কোম্পানি, অথবা এমনকি প্রবেশ-প্রস্থান পরিদর্শন এবং কোয়ারেন্টাইন ব্যুরো, পরিবেশ পর্যবেক্ষণ বিভাগ, হাসপাতাল এবং অন্যান্য ইউনিটের কর্মচারী, আপনি কমবেশি সংস্পর্শে আসবেন বা আপনার পিসিআর কোয়ান্টেটিভ আয়তনের জ্ঞানের প্রয়োজন হবে।

রিয়েল টাইম পিসিআর এর নীতি

রিয়েল টাইম পিসিআর হল একটি পদ্ধতি যেখানে ফ্লুরোসেন্ট পদার্থগুলি পিসিআর প্রতিক্রিয়া সিস্টেমে যোগ করা হয়, এবং পিসিআর প্রতিক্রিয়া প্রক্রিয়ায় ফ্লুরোসেন্স সংকেতের তীব্রতা একটি পরিমাণগত পিসিআর যন্ত্র দ্বারা বাস্তব সময়ে নিরীক্ষণ করা হয় এবং অবশেষে পরীক্ষামূলক ডেটা বিশ্লেষণ এবং প্রক্রিয়া করা হয়।

【পরিবর্ধন বক্ররেখা】পিসিআর এর গতিশীল প্রক্রিয়া বর্ণনা করে বক্ররেখা।PCR-এর পরিবর্ধন বক্ররেখা আসলে একটি আদর্শ সূচকীয় বক্ররেখা নয়, কিন্তু একটি সিগমায়েড বক্ররেখা।

[পরিবর্ধন বক্ররেখার প্ল্যাটফর্ম পর্যায়]পিসিআর চক্রের সংখ্যা বৃদ্ধির সাথে, ডিএনএ পলিমারেজের নিষ্ক্রিয়তা, ডিএনটিপি এবং প্রাইমারের ক্ষয়, এবং বাই-প্রোডাক্ট পাইরোফসফেট ইত্যাদি দ্বারা সংশ্লেষণ প্রতিক্রিয়ার বাধা, ইত্যাদি, পিসিআর সর্বদা দ্রুতগতিতে প্রসারিত হয় না।, এবং অবশেষে একটি মালভূমিতে প্রবেশ করবে।

[এম্পলিফিকেশন বক্ররেখার সূচকীয় বৃদ্ধির অঞ্চল]যদিও মালভূমির পর্যায় ব্যাপকভাবে পরিবর্তিত হয়, পরিবর্ধন বক্ররেখার সূচকীয় বৃদ্ধি অঞ্চলের একটি নির্দিষ্ট অঞ্চলে, পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা খুব ভাল, যা PCR-এর পরিমাণগত বিশ্লেষণের জন্য খুবই গুরুত্বপূর্ণ।

[থ্রেশহোল্ড মান এবং Ct মান]আমরা পরিবর্ধন বক্ররেখার সূচকীয় বৃদ্ধির ক্ষেত্রে উপযুক্ত অবস্থানে ফ্লুরোসেন্স সনাক্তকরণের সীমা মান নির্ধারণ করি, যথা থ্রেশহোল্ড মান (থ্রেশহোল্ড)।থ্রেশহোল্ড মান এবং পরিবর্ধন বক্ররেখার ছেদ হল Ct মান, অর্থাৎ, থ্রেশহোল্ড মান পৌঁছে গেলে Ct মান চক্রের সংখ্যা (থ্রেশহোল্ড চক্র) নির্দেশ করে।

নীচের গ্রাফটি স্পষ্টভাবে থ্রেশহোল্ড লাইন এবং পরিবর্ধন বক্ররেখা, থ্রেশহোল্ড এবং Ct মানের মধ্যে সম্পর্ক দেখায়।

【কিভাবে পরিমাপ করা যায়?】

এটি গাণিতিক তত্ত্ব দ্বারা প্রমাণিত হয়েছে যে Ct মানের প্রাথমিক টেমপ্লেটের সংখ্যার লগারিদমের সাথে একটি বিপরীত রৈখিক সম্পর্ক রয়েছে।রিয়েল টাইম পিসিআর রিয়েল টাইমে পিসিআর পরিবর্ধন পণ্যগুলি নিরীক্ষণ করে এবং সূচকীয় পরিবর্ধন পর্বের সময় তাদের পরিমাণ নির্ধারণ করে।

পিসিআর-এর প্রতিটি চক্রের জন্য, ডিএনএ দ্রুতগতিতে 2 গুণ বৃদ্ধি পেয়েছে এবং শীঘ্রই একটি মালভূমিতে পৌঁছেছে।

ধরে নিচ্ছি যে DNA শুরুর পরিমাণ A₀ , n চক্রের পরে, DNA পণ্যের তাত্ত্বিক পরিমাণকে এভাবে প্রকাশ করা যেতে পারে:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

তারপর, প্রাথমিক DNA পরিমাণ A 0 যত বেশি হবে, তত তাড়াতাড়ি পরিবর্ধিত পণ্যের পরিমাণ সনাক্তকরণ মান An এ পৌঁছাবে এবং An-এ পৌঁছানোর সময় চক্রের সংখ্যা হল Ct মান।অর্থাৎ, প্রাথমিক ডিএনএ পরিমাণ A 0 যত বেশি হবে, পরিবর্ধন বক্ররেখা তত বেশি হবে, এবং তদনুসারে প্রয়োজনীয় সংখ্যক চক্র n কম হবে।

আমরা পরিচিত ঘনত্বের মানকে গ্রেডিয়েন্ট ডিলিউশন করি এবং এটিকে রিয়েল টাইম পিসিআর-এর জন্য একটি টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহার করি এবং ডিএনএ পরিমাণ কম থেকে শুরু করার ক্রমে সমান বিরতিতে একটি ক্রমবর্ধক বক্ররেখা পাওয়া যাবে।Ct মান এবং প্রারম্ভিক টেমপ্লেটের সংখ্যার লগারিদমের মধ্যে রৈখিক সম্পর্ক অনুসারে, একটি[স্ট্যান্ডার্ড কার্ভ] তৈরি করা যেতে পারে।

স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখাতে অজানা ঘনত্ব সহ নমুনার Ct মান প্রতিস্থাপন করে, অজানা ঘনত্ব সহ নমুনার প্রাথমিক টেমপ্লেট পরিমাণ পাওয়া যেতে পারে, যা রিয়েল টাইম পিসিআর-এর পরিমাণগত নীতি।

রিয়েল টাইম পিসিআর সনাক্তকরণ পদ্ধতি

রিয়েল টাইম পিসিআর প্রতিক্রিয়া সিস্টেমে ফ্লুরোসেন্স তীব্রতা সনাক্ত করে পিসিআর পরিবর্ধন পণ্য সনাক্ত করে।

ফ্লুরোসেন্ট ডাই এম্বেডিং পদ্ধতির নীতি】

ফ্লুরোসেন্ট রং, যেমন টিবি গ্রিন ®, পিসিআর সিস্টেমে অনির্দিষ্টভাবে ডবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ-তে আবদ্ধ হতে পারে এবং বাঁধার সময় ফ্লুরোসেস করতে পারে।

PCR চক্র বৃদ্ধির সাথে প্রতিক্রিয়া সিস্টেমে ফ্লুরোসেন্সের তীব্রতা দ্রুত বৃদ্ধি পেয়েছে।ফ্লুরোসেন্সের তীব্রতা সনাক্ত করে, প্রতিক্রিয়া সিস্টেমে ডিএনএ পরিবর্ধনের পরিমাণ বাস্তব সময়ে নিরীক্ষণ করা যেতে পারে এবং তারপরে নমুনায় শুরু হওয়া টেমপ্লেটের পরিমাণ বিপরীতভাবে অনুমান করা যেতে পারে।

【ফ্লুরোসেন্ট প্রোব পদ্ধতির নীতি】

ফ্লুরোসেন্ট প্রোবএকটি নিউক্লিক অ্যাসিড ক্রম যার 5′ প্রান্তে একটি ফ্লুরোসেন্ট গ্রুপ এবং 3′ প্রান্তে একটি quenching গ্রুপ রয়েছে, যা বিশেষভাবে টেমপ্লেটের সাথে আবদ্ধ হতে পারে।যখন প্রোবটি অক্ষত থাকে, ফ্লুরোফোর দ্বারা নির্গত ফ্লুরোসেন্সটি quenching গ্রুপ দ্বারা নিভিয়ে দেওয়া হয় এবং প্রতিপ্রভ হতে পারে না।প্রোবটি পচে গেলে, ফ্লুরোসেন্ট পদার্থটি বিচ্ছিন্ন হয়ে প্রতিপ্রভ নির্গত করবে।

পিসিআর প্রতিক্রিয়া সমাধানে একটি ফ্লুরোসেন্ট প্রোব যোগ করা হয়।অ্যানিলিং প্রক্রিয়া চলাকালীন, ফ্লুরোসেন্ট প্রোবটি টেমপ্লেটের নির্দিষ্ট অবস্থানে আবদ্ধ হবে।এক্সটেনশন প্রক্রিয়া চলাকালীন, পিসিআর এনজাইমের 5′→3′ এক্সোনিউক্লিজ অ্যাক্টিভিটি টেমপ্লেটের সাথে সংকরিত ফ্লুরোসেন্ট প্রোবকে পচিয়ে দিতে পারে এবং ফ্লুরোসেন্ট পদার্থটি ফ্লুরোসেন্স নির্গত করার জন্য বিচ্ছিন্ন হয়ে যায়।প্রতিক্রিয়া পদ্ধতিতে প্রোবের ফ্লুরোসেন্স তীব্রতা সনাক্ত করে, পিসিআর পণ্যের পরিবর্ধন পরিমাণ নিরীক্ষণের উদ্দেশ্য অর্জন করা যেতে পারে।

【ফ্লুরোসেন্স সনাক্তকরণ পদ্ধতি নির্বাচন】

যদি এটি উচ্চ হোমোলজির সাথে সিকোয়েন্সগুলিকে আলাদা করতে এবং এসএনপি টাইপিং বিশ্লেষণের মতো মাল্টিপ্লেক্স পিসিআর সনাক্তকরণ করতে ব্যবহৃত হয় তবে ফ্লুরোসেন্ট প্রোব পদ্ধতিটি অপরিবর্তনীয়।
অন্যান্য রিয়েল টাইম পিসিআর পরীক্ষার জন্য, একটি সহজ, সহজ এবং কম খরচে ফ্লুরোসেন্ট কাইমেরা পদ্ধতি ব্যবহার করা যেতে পারে।

প্রোবস শক্তিশালী নির্দিষ্টতা, মাল্টিপ্লেক্স পিসিআর করতে সক্ষম

ঘাটতি

পরিবর্ধন জন্য উচ্চ নির্দিষ্টতা প্রয়োজনীয়তা;

মাল্টিপ্লেক্স পিসিআর করা যাবে না নির্দিষ্ট প্রোব ডিজাইন করার প্রয়োজন, উচ্চ খরচ;

কখনও কখনও প্রোবের নকশা কঠিন

সংশ্লিষ্ট পণ্য: