Ct মান হল ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত PCR-এর সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ ফলাফল উপস্থাপনা ফর্ম।এটি জিনের অভিব্যক্তি পার্থক্য বা জিন অনুলিপি সংখ্যা গণনা করতে ব্যবহৃত হয়।তাহলে ফ্লুরোসেন্স কোয়ান্টিফিকেশনের Ct মান কী যুক্তিসঙ্গত বলে বিবেচিত হয়?কিভাবে Ct মানের কার্যকর পরিসীমা নিশ্চিত করবেন?

Ct মান কি?
qPCR পরিবর্ধন প্রক্রিয়া চলাকালীন, পরিবর্ধন চক্রের সংশ্লিষ্ট সংখ্যা (সাইকেল থ্রেশহোল্ড) যখন পরিবর্ধিত পণ্যের ফ্লুরোসেন্স সংকেত সেট ফ্লুরোসেন্স থ্রেশহোল্ডে পৌঁছায়।C মানে সাইকেল এবং T মানে থ্রেশহোল্ড।সহজভাবে বললে, Ct মান হল সেই চক্রের সংখ্যা যা প্রারম্ভিক টেমপ্লেট পরিবর্ধন যখন qPCR-তে পণ্যের একটি নির্দিষ্ট পরিমাণে পৌঁছায়।তথাকথিত "একটি নির্দিষ্ট পরিমাণ পণ্য" পরে আরও ব্যাখ্যা করা হবে।

Ct মান কি করে?

1. সূচকীয় পরিবর্ধন, টেমপ্লেট পরিমাণ এবং Ct মানের মধ্যে সম্পর্ক
আদর্শভাবে, qPCR-তে জিনগুলি নির্দিষ্ট সংখ্যক চক্রের পরে সূচকীয় পরিবর্ধন দ্বারা সঞ্চিত হয়।পরিবর্ধন চক্রের সংখ্যা এবং পণ্যের পরিমাণের মধ্যে সম্পর্ক হল: পরিবর্ধিত পণ্যের পরিমাণ = প্রাথমিক টেমপ্লেট পরিমাণ × (1+En) চক্র সংখ্যা।যাইহোক, qPCR প্রতিক্রিয়া সবসময় একটি আদর্শ পরিস্থিতিতে হয় না।যখন পরিবর্ধিত পণ্যের পরিমাণ একটি "নির্দিষ্ট পণ্যের পরিমাণ" এ পৌঁছায়, তখন এই সময়ে চক্রের সংখ্যা হল Ct মান, এবং এটি সূচকীয় পরিবর্ধন সময়কালের মধ্যে থাকে।Ct মান এবং প্রারম্ভিক টেমপ্লেটের পরিমাণের মধ্যে সম্পর্ক: টেমপ্লেটের Ct মান এবং টেমপ্লেটের প্রারম্ভিক কপি নম্বরের লগারিদমের মধ্যে একটি রৈখিক সম্পর্ক রয়েছে।প্রাথমিক টেমপ্লেটের ঘনত্ব যত বেশি হবে, Ct মান তত কম হবে;প্রাথমিক টেমপ্লেটের ঘনত্ব যত কম হবে, Ct মান তত বেশি হবে।

2. পরিবর্ধন বক্ররেখা, ফ্লুরোসেন্স থ্রেশহোল্ড এবং নির্দিষ্ট পিসিআর পণ্যের পরিমাণ
qPCR পরিবর্ধন পণ্যের পরিমাণ সরাসরি ফ্লুরোসেন্ট সংকেত আকারে উপস্থাপিত হয়, অর্থাৎ, পরিবর্ধন বক্ররেখা।PCR-এর প্রাথমিক পর্যায়ে, পরিবর্ধন আদর্শ অবস্থার অধীনে হয়, চক্রের সংখ্যা ছোট, পণ্য জমা হয় ছোট, এবং প্রতিপ্রভের মাত্রা স্পষ্টভাবে ফ্লুরোসেন্স পটভূমি থেকে আলাদা করা যায় না।এর পরে, ফ্লুরোসেন্স বৃদ্ধি পায় এবং সূচকীয় পর্যায়ে প্রবেশ করে।PCR পণ্যের পরিমাণ একটি নির্দিষ্ট সময়ে সনাক্ত করা যেতে পারে যখন PCR প্রতিক্রিয়া শুধুমাত্র সূচকীয় পর্যায়ে থাকে, যা "একটি নির্দিষ্ট পরিমাণ পণ্য" হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে, এবং টেমপ্লেটের প্রাথমিক বিষয়বস্তু এটি থেকে অনুমান করা যেতে পারে।অতএব, একটি নির্দিষ্ট পরিমাণ পণ্যের সাথে সঙ্গতিপূর্ণ ফ্লুরোসেন্স সংকেত তীব্রতা হল ফ্লুরোসেন্স থ্রেশহোল্ড।

PCR-এর শেষ পর্যায়ে, পরিবর্ধন বক্ররেখা আর সূচকীয় পরিবর্ধন দেখায় না এবং রৈখিক পর্যায় এবং মালভূমি পর্যায়ে প্রবেশ করে।

3. Ct মানের প্রজননযোগ্যতা
যখন PCR চক্র Ct মানের সাইকেল নম্বরে পৌঁছায়, তখন এটি সত্যিকারের সূচকীয় পরিবর্ধন সময়ের মধ্যে প্রবেশ করেছে।এই সময়ে, ছোট ত্রুটিটি বিবর্ধিত করা হয়নি, তাই Ct মানের পুনরুত্পাদনযোগ্যতা চমৎকার, অর্থাৎ একই টেমপ্লেটটি বিভিন্ন সময়ে বা একই সময়ে বিভিন্ন টিউবে বিবর্ধিত হয়।পরিবর্ধন, প্রাপ্ত Ct মান ধ্রুবক।

1. পরিবর্ধন দক্ষতা En
পিসিআর পরিবর্ধন দক্ষতা বলতে সেই দক্ষতাকে বোঝায় যার সাহায্যে পলিমারেজ জিনকে একটি অ্যামপ্লিকনে পরিণত করার জন্য রূপান্তরিত করে।যখন একটি ডিএনএ অণু দুটি ডিএনএ অণুতে রূপান্তরিত হয় তখন পরিবর্ধন দক্ষতা 100% হয়।পরিবর্ধন দক্ষতা সাধারণত En হিসাবে প্রকাশ করা হয়।পরবর্তী নিবন্ধগুলির বিশ্লেষণের সুবিধার্থে, পরিবর্ধন দক্ষতাকে প্রভাবিত করে এমন কারণগুলি সংক্ষিপ্তভাবে উপস্থাপন করা হয়েছে।

2. Ct মানের পরিসর
Ct মান 15-35 পর্যন্ত।যদি Ct মান 15-এর কম হয়, তাহলে বিবেচনা করা হয় যে পরিবর্ধনটি বেসলাইন পিরিয়ডের সীমার মধ্যে এবং ফ্লুরোসেন্স থ্রেশহোল্ডে পৌঁছেনি।আদর্শভাবে, Ct মান এবং টেমপ্লেটের প্রাথমিক কপি নম্বরের লগারিদমের মধ্যে একটি রৈখিক সম্পর্ক রয়েছে, অর্থাৎ, আদর্শ বক্ররেখা।স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখার মাধ্যমে, যখন পরিবর্ধন দক্ষতা 100% হয়, তখন জিনের একক অনুলিপি সংখ্যা পরিমাপ করার জন্য গণনাকৃত Ct মান প্রায় 35 হয়। যদি এটি 35-এর বেশি হয়, তাহলে টেমপ্লেটের প্রাথমিক কপি নম্বর তাত্ত্বিকভাবে 1-এর চেয়ে কম, যা অর্থহীন বলে বিবেচিত হতে পারে।

বিভিন্ন জিন Ct রেঞ্জের জন্য, প্রাথমিক টেমপ্লেট পরিমাণে জিন কপি নম্বর এবং পরিবর্ধন দক্ষতার পার্থক্যের কারণে, জিনের জন্য একটি আদর্শ বক্ররেখা তৈরি করা এবং জিনের রৈখিক সনাক্তকরণ পরিসর গণনা করা প্রয়োজন।

3. Ct মানের ফ্যাক্টরকে প্রভাবিত করে
পরিবর্ধন চক্রের সংখ্যা এবং পণ্যের পরিমাণের মধ্যে সম্পর্ক থেকে: পরিবর্ধিত পণ্যের পরিমাণ = প্রাথমিক টেমপ্লেট × (1+En) চক্র সংখ্যার পরিমাণ, এটি দেখা যায় যে আদর্শ অবস্থার অধীনে, প্রাথমিক টেমপ্লেট এবং En-এর পরিমাণ Ct মানের উপর নেতিবাচক প্রভাব ফেলবে।টেমপ্লেট গুণমান বা পরিবর্ধন দক্ষতার পার্থক্যের কারণে Ct মান খুব বড় বা খুব ছোট হবে।

4.Ct মান খুব বড় বা খুব ছোট