qPCR পরীক্ষায়, প্রাইমার ডিজাইন একটি খুব গুরুত্বপূর্ণ লিঙ্ক।প্রাইমারগুলি উপযুক্ত কিনা তা ঘনিষ্ঠভাবে পরিবর্ধন কার্যকারিতা স্ট্যান্ডার্ডে পৌঁছায় কিনা, পরিবর্ধিত পণ্যগুলি নির্দিষ্ট কিনা এবং পরীক্ষামূলক ফলাফল পাওয়া যায় কিনা তার সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত।
তাহলে কিভাবে qPCR প্রাইমারের সুনির্দিষ্টতা আরও ভালো করা যায়?উচ্চ পরিবর্ধন দক্ষতা?
আজ, আমরা আপনাকে একসাথে qPCR প্রাইমার ডিজাইন করতে নিয়ে যাব, এবং qPCR প্রাইমার ডিজাইনকে পরীক্ষা-নিরীক্ষায় একটি দক্ষ জ্ঞানের দক্ষতায় পরিণত হতে দিন।
qPCR প্রাইমার ডিজাইন করার সময়, সাধারণত নিম্নলিখিত বিষয়গুলিতে মনোযোগ দিন: প্রাইমারগুলি যতটা সম্ভব ইন্ট্রোন জুড়ে ডিজাইন করা উচিত, পণ্যের দৈর্ঘ্য 100-300 bp হওয়া উচিত, Tm মান যতটা সম্ভব 60°C এর কাছাকাছি হওয়া উচিত, এবং আপস্ট্রিম এবং ডাউনস্ট্রিম প্রাইমারগুলি যতটা সম্ভব কাছাকাছি হওয়া উচিত, এবং প্রাইমারের শেষ G বা C হওয়া উচিত, ইত্যাদি অপেক্ষা করুন।
1. প্রাইমারের নকশা বিস্তৃত ইন্ট্রোন
qPCR প্রাইমার ডিজাইন করার সময়, ইন্ট্রোন জুড়ে ডিজাইন করা প্রাইমার বেছে নেওয়ার ফলে জিডিএনএ টেমপ্লেটকে প্রশস্ত করা থেকে বিরত রাখা যায়, এবং পণ্যগুলি সবই সিডিএনএ-এর পরিবর্ধন থেকে উদ্ভূত হয়, এইভাবে জিডিএনএ দূষণের প্রভাব দূর করে।
2. প্রাইমার দৈর্ঘ্য
প্রাইমারের দৈর্ঘ্য সাধারণত 18-30 nt এর মধ্যে হয় এবং পরিবর্ধন পণ্যের দৈর্ঘ্য যতটা সম্ভব 100-300 bp এর মধ্যে নিয়ন্ত্রণ করা উচিত।
যদি প্রাইমারটি খুব ছোট হয় তবে এটি অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনের দিকে পরিচালিত করবে এবং যদি এটি খুব দীর্ঘ হয় তবে এটি সহজেই গৌণ কাঠামো তৈরি করবে (যেমন হেয়ারপিনের গঠন)।যদি পরিবর্ধন পণ্যটি খুব দীর্ঘ হয় তবে এটি পলিমারেজের প্রতিক্রিয়ার জন্য উপযুক্ত নয়, যা পিসিআর পরিবর্ধনের দক্ষতাকে প্রভাবিত করবে।
3. GC বিষয়বস্তু এবং Tm মান
প্রাইমারের GC বিষয়বস্তু 40% এবং 60% এর মধ্যে নিয়ন্ত্রণ করা উচিত।যদি এটি খুব বেশি বা খুব কম হয় তবে এটি প্রতিক্রিয়া শুরু করার পক্ষে উপযুক্ত নয়।একই Tm মান এবং অ্যানিলিং তাপমাত্রা পাওয়ার জন্য ফরোয়ার্ড এবং রিভার্স প্রাইমারগুলির GC বিষয়বস্তু একই কাছাকাছি হওয়া উচিত।
Tm মান যতদূর সম্ভব 55-65°C এর মধ্যে হওয়া উচিত, সাধারণত 60°C এর কাছাকাছি, এবং আপস্ট্রিম এবং ডাউনস্ট্রিমের Tm মান যতটা সম্ভব কাছাকাছি হওয়া উচিত, বিশেষত 4°C এর বেশি নয়।
4. প্রাইমারের 3′ শেষে A নির্বাচন করা এড়িয়ে চলুন
যখন প্রাইমারের 3′ প্রান্তটি অমিল হয়, তখন বিভিন্ন ঘাঁটির সংশ্লেষণ দক্ষতার মধ্যে বড় পার্থক্য থাকে।যখন শেষ বেসটি A হয়, তখন এটি অমিলের ক্ষেত্রেও চেইন সংশ্লেষণ শুরু করতে পারে এবং যখন শেষ বেসটি হয় T When, অমিল আনয়নের কার্যকারিতা ব্যাপকভাবে হ্রাস পায়।অতএব, প্রাইমারের 3′ শেষে A বেছে নেওয়া এড়াতে চেষ্টা করুন এবং T বেছে নেওয়াই ভালো।
যদি এটি একটি প্রোব প্রাইমার হয়, তবে প্রোবের 5′ প্রান্তটি G হতে পারে না, কারণ এমনকি যখন একটি একক G বেস FAM ফ্লুরোসেন্ট রিপোর্টার গ্রুপের সাথে সংযুক্ত থাকে, G FAM গ্রুপ দ্বারা নির্গত ফ্লুরোসেন্ট সংকেতকেও নিভিয়ে দিতে পারে, যার ফলে মিথ্যা নেতিবাচক ফলাফল হয়।হাজির।
5. বেস বিতরণ
প্রাইমারে চারটি ঘাঁটির বণ্টন পছন্দনীয়ভাবে এলোমেলো, 3′ শেষে 3টির বেশি পরপর G বা C এড়িয়ে যাওয়া এবং পরপর 3টির বেশিজি বা সি জিসি-সমৃদ্ধ সিকোয়েন্স অঞ্চলে পেয়ারিং তৈরি করা সহজ।
6. প্রাইমার ডিজাইন অঞ্চলে জটিল গৌণ কাঠামো এড়ানো উচিত।
পরিবর্ধন পণ্যের একক স্ট্র্যান্ড দ্বারা গঠিত গৌণ কাঠামো পিসিআর-এর মসৃণ অগ্রগতিকে প্রভাবিত করবে।লক্ষ্য ক্রমটিতে একটি গৌণ কাঠামো রয়েছে কিনা তা আগে থেকেই অনুমান করে, প্রাইমারগুলির নকশায় এই অঞ্চলটি এড়ানোর চেষ্টা করুন।
7. প্রাইমারগুলি নিজেরাই এবং প্রাইমারগুলির মধ্যে পরপর পরিপূরক ঘাঁটিগুলি এড়াতে চেষ্টা করা উচিত।
প্রাইমার নিজেই এবং প্রাইমারের মধ্যে পরপর 4 বেস পরিপূরকতা থাকতে পারে না।প্রাইমারের নিজেই একটি পরিপূরক ক্রম থাকা উচিত নয়, অন্যথায় এটি নিজেকে ভাঁজ করে একটি হেয়ারপিন গঠন তৈরি করবে, যা প্রাইমার এবং টেমপ্লেটের অ্যানিলিং সংমিশ্রণকে প্রভাবিত করবে।
আপস্ট্রিম এবং ডাউনস্ট্রিম প্রাইমারের মধ্যে পরিপূরক ক্রম বিদ্যমান থাকতে পারে না।প্রাইমারগুলির মধ্যে পরিপূরকতা প্রাইমার ডাইমার তৈরি করবে, যা পিসিআর দক্ষতা হ্রাস করবে এবং এমনকি পরিমাণগত নির্ভুলতাকেও প্রভাবিত করবে।যদি প্রাইমার-ডাইমার এবং হেয়ারপিন স্ট্রাকচার অনিবার্য হয়, △G মান খুব বেশি হওয়া উচিত নয় (4.5 kcal/mol এর কম হওয়া উচিত)।
8. প্রাইমারগুলি লক্ষ্য নির্দিষ্ট পণ্যকে প্রশস্ত করে।
কিউপিসিআর সনাক্তকরণের চূড়ান্ত লক্ষ্য লক্ষ্য জিনের প্রাচুর্য বোঝা।অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন ঘটলে, পরিমাপ সঠিক হবে না।অতএব, প্রাইমারগুলি ডিজাইন করার পরে, তাদের BLAST দ্বারা পরীক্ষা করা দরকার, এবং পণ্যগুলির নির্দিষ্টতা সিকোয়েন্স ডাটাবেসে তুলনা করা হয়।
এরপরে, আমরা কিউপিসিআর প্রাইমার ডিজাইন করার জন্য মানব GAS6 (গ্রোথ অ্যারেস্ট স্পেসিফিক 6) জিনকে উদাহরণ হিসেবে নিই।
01 কোয়েরি জিন
হোমো GAS6NCBI এর মাধ্যমে।এখানে, আমাদের জিনের নাম এবং প্রজাতির তুলনা করার দিকে মনোযোগ দেওয়া উচিত যাতে তারা সামঞ্জস্যপূর্ণ হয়।
02 জিন ক্রম খুঁজুন
(1) যদি লক্ষ্য ক্রমটি জিনোমিক ডিএনএ হয় তবে প্রথমটি নির্বাচন করুন, যা জিনের জিনোমিক ডিএনএ ক্রম।
(2) লক্ষ্য ক্রম mRNA হলে, দ্বিতীয়টি নির্বাচন করুন।প্রবেশ করার পরে, নীচের টেবিলে "CDS" এ ক্লিক করুন।ব্রাউন ব্যাকগ্রাউন্ড সিকোয়েন্স হল জিনের কোডিং সিকোয়েন্স।
03 ডিজাইন প্রাইমার
প্রাইমার-ব্লাস্ট ইন্টারফেস লিখুন
উপরের বাম দিকে জিন সিকোয়েন্স নম্বর বা ফাস্তা ফরম্যাটে সিকোয়েন্স লিখুন এবং প্রাসঙ্গিক প্যারামিটারগুলি পূরণ করুন।

"প্রাইমার পান" এ ক্লিক করুন এবং NCBI পপ আপ করে আপনাকে বলবে যে এই ধরনের পরামিতি নির্বাচন অন্যান্য স্প্লিসিং ভেরিয়েন্টে প্রশস্ত করা হবে।আমরা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলাদা আলোচনা করতে পারি।এই প্রক্রিয়াটি চালানোর জন্য কয়েক সেকেন্ড সময় লাগতে পারে।
এই প্রাইমার জোড়ার অ্যানিলিং তাপমাত্রা প্রায় 60 ডিগ্রি সেলসিয়াস।পরীক্ষার উদ্দেশ্য অনুসারে, পরীক্ষার জন্য মাঝারি দৈর্ঘ্য, ভাল নির্দিষ্টতা এবং কম স্ব-পরিপূরক সহ প্রাইমারগুলি বেছে নিন এবং সাফল্যের হার বেশ বেশি!
04প্রাইমার নির্দিষ্টতা যাচাইকরণ
প্রকৃতপক্ষে, প্রাইমার ডিজাইন করার পাশাপাশি, প্রাইমার-ব্লাস্ট আমরা নিজেরাই ডিজাইন করা প্রাইমারগুলিকে মূল্যায়ন করতে পারে।প্রাইমার ডিজাইন পৃষ্ঠায় ফিরে যান, আমাদের ডিজাইন করা আপস্ট্রিম এবং ডাউনস্ট্রিম প্রাইমারগুলি লিখুন এবং অন্যান্য প্যারামিটারগুলি সামঞ্জস্য করা হবে না।জমা দেওয়ার পরে, আপনি দেখতে পারেন যে প্রাইমারগুলির জোড়া অন্যান্য জিনেও বিদ্যমান কিনা।যদি তাদের সমস্ত জিনের উপর প্রদর্শিত হয় যা আমরা প্রসারিত করতে চাই, ইঙ্গিত করে যে এই জোড়া প্রাইমারের নির্দিষ্টতা দুর্দান্ত!(উদাহরণস্বরূপ, এটি প্রাইমার কোয়েরির একমাত্র ফলাফল!)

05 প্রাইমার মানের রায়
"নিখুঁত" প্রাইমার কি ধরনের প্রাইমার যা "মান পর্যন্ত পরিবর্ধন দক্ষতা", "পরিবর্ধিত পণ্য বৈশিষ্ট্য", এবং "নির্ভরযোগ্য পরীক্ষামূলক ফলাফল" একত্রিত করে?
পরিবর্ধন দক্ষতা

গলে যাওয়া বক্ররেখা
প্রাইমারগুলির পরিবর্ধন কার্যকারিতা 90%-110% পর্যন্ত পৌঁছায়, যার অর্থ হল পরিবর্ধন কার্যকারিতা ভাল, এবং গলে যাওয়া বক্ররেখার একটি একক শিখর রয়েছে এবং সাধারণত Tm>80°C, যার অর্থ হল পরিবর্ধনের নির্দিষ্টতা ভাল।
 
সংশ্লিষ্ট পণ্য:
রিয়েল টাইম পিসিআর ইজি-সাইবিআর গ্রীন আই
রিয়েল টাইম পিসিআর ইজি-তাকমান