প্রাইমার ডিজাইনের ভিত্তিতে (99% সমস্যা সমাধান করা যেতে পারে)
1. প্রাইমার দৈর্ঘ্য: পাঠ্যপুস্তকের 15-30bp প্রয়োজন, সাধারণত প্রায় 20bp।নির্দিষ্টতা নিশ্চিত করার জন্য প্রকৃত অবস্থা 18-24bp হওয়া ভালো, কিন্তু যত দীর্ঘ হবে তত ভালো, অত্যধিক লম্বা প্রাইমারও নির্দিষ্টতা কমিয়ে দেবে এবং ফলনও কমিয়ে দেবে।
2. প্রাইমার অ্যামপ্লিফিকেশন স্প্যান: 200-500bp উপযুক্ত, এবং নির্দিষ্ট অবস্থার অধীনে খণ্ডটি 10kb পর্যন্ত প্রসারিত করা যেতে পারে।
3. প্রাইমার বেস: G+C-এর বিষয়বস্তু 40-60% হওয়া উচিত, খুব কম G+C পরিবর্ধন প্রভাব ভাল নয়, খুব বেশি G+C অ-নির্দিষ্ট ব্যান্ডগুলি প্রদর্শিত হওয়া সহজ।ATGC 5টির বেশি পিউরিন বা পাইরিমিডিন নিউক্লিওটাইডের ক্লাস্টার এড়িয়ে এলোমেলোভাবে বিতরণ করা হয়।স্থিতিশীলতা বাড়ানোর জন্য 5′ শেষ এবং মধ্যবর্তী ক্রমগুলির জন্য মাল্টি-জিসি, 3′ প্রান্তে সমৃদ্ধ GC এড়িয়ে চলুন, শেষ 3টি ঘাঁটির জন্য কোনও GC নেই, বা শেষ 5টির মধ্যে 3টির জন্য কোনও GC নেই৷
4. প্রাইমারগুলিতে সেকেন্ডারি স্ট্রাকচার এড়িয়ে চলুন এবং দুটি প্রাইমারের মধ্যে পরিপূরক এড়িয়ে চলুন, বিশেষ করে 3 'এন্ডে কমপ্লিমেন্টেশন, অন্যথায় প্রাইমার ডাইমার তৈরি হবে এবং অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধিত ব্যান্ড তৈরি হবে।
5. প্রাইমারের 3' প্রান্তে অবস্থিত ঘাঁটিগুলি, বিশেষ করে শেষ এবং শেষের ঘাঁটিগুলি, জোড়াহীন টার্মিনাল ঘাঁটির কারণে পিসিআর ব্যর্থতা এড়াতে কঠোরভাবে যুক্ত করা উচিত৷
6. প্রাইমারগুলিতে উপযুক্ত ক্লিভেজ সাইট আছে বা যোগ করা যেতে পারে, এবং পরিবর্ধিত টার্গেট সিকোয়েন্সে উপযুক্ত ক্লিভেজ সাইট থাকতে হবে, যা ক্লিভেজ বিশ্লেষণ বা আণবিক ক্লোনিংয়ের জন্য খুবই উপকারী।
7. প্রাইমারের নির্দিষ্টতা: প্রাইমারগুলির নিউক্লিক অ্যাসিড সিকোয়েন্স ডাটাবেসের অন্যান্য সিকোয়েন্সের সাথে কোনও সুস্পষ্ট হোমোলজি থাকা উচিত নয়।
8. সফটওয়্যার ব্যবহার করতে শিখুন: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (এই অনলাইন ডিজাইনটি সবচেয়ে ভালো কাজ করে)।
উপরের বিষয়বস্তু অন্তত 99% প্রাইমার ডিজাইন সমস্যার সমাধান করতে পারে।
প্রাইমার ডিজাইনের বিবরণ নিয়ন্ত্রণ করুন
1. প্রাইমার দৈর্ঘ্য
সাধারণ প্রাইমারের দৈর্ঘ্য 18~30 বেস।সাধারণভাবে, প্রাইমারের অ্যানিলিং তাপমাত্রা নির্ধারণের সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ ফ্যাক্টর হল প্রাইমারের দৈর্ঘ্য।প্রাইমারের অ্যানিলিং তাপমাত্রা সাধারণত নির্বাচিত হয় (Tm মান -5℃), এবং কিছু সরাসরি Tm মান ব্যবহার করে।প্রাইমারগুলির অ্যানিলিং তাপমাত্রা মোটামুটিভাবে গণনা করতে নিম্নলিখিত সূত্রগুলি ব্যবহার করা যেতে পারে।
যখন প্রাইমারের দৈর্ঘ্য 20bp এর কম হয়: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
প্রাইমারের দৈর্ঘ্য 20bp-এর বেশি হলে: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/দৈর্ঘ্য-5℃
উপরন্তু, অনেক সফ্টওয়্যার এছাড়াও annealing তাপমাত্রা গণনা করতে ব্যবহার করা যেতে পারে, গণনার নীতি ভিন্ন হবে, তাই কখনও কখনও গণনা করা মান একটি ছোট ফাঁক থাকতে পারে.PCR প্রতিক্রিয়া অপ্টিমাইজ করার জন্য, সবচেয়ে ছোট প্রাইমার যা 54℃ এর কম নয় এমন অ্যানিলিং তাপমাত্রা নিশ্চিত করে তা সর্বোত্তম দক্ষতা এবং নির্দিষ্টতার জন্য ব্যবহার করা হয়।
সামগ্রিকভাবে, প্রাইমারের নির্দিষ্টতা প্রতিটি অতিরিক্ত নিউক্লিওটাইডের জন্য চারটি ফ্যাক্টর দ্বারা বৃদ্ধি পায়, যাতে বেশিরভাগ অ্যাপ্লিকেশনের জন্য ন্যূনতম প্রাইমারের দৈর্ঘ্য হয় 18 নিউক্লিওটাইড।প্রাইমার দৈর্ঘ্যের উপরের সীমা খুব গুরুত্বপূর্ণ নয়, প্রধানত প্রতিক্রিয়া দক্ষতার সাথে সম্পর্কিত।এনট্রপির কারণে, প্রাইমার যত দীর্ঘ হবে, ডিএনএ পলিমারেজকে আবদ্ধ করার জন্য একটি স্থিতিশীল ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড টেমপ্লেট তৈরি করতে লক্ষ্য ডিএনএর সাথে আবদ্ধ হওয়ার হার তত কম।
প্রাইমার ডিজাইন করার জন্য সফ্টওয়্যার ব্যবহার করার সময়, প্রাইমারের দৈর্ঘ্য টিএম মান দ্বারা নির্ধারিত করা যেতে পারে, বিশেষ করে ফ্লুরোসেন্স কোয়ান্টিটেটিভ পিসিআর-এর প্রাইমারগুলির জন্য, TM=60℃ বা এর মতো নিয়ন্ত্রণ করা উচিত।
2.GC বিষয়বস্তু
সাধারণত, প্রাইমার সিকোয়েন্সে G+C-এর বিষয়বস্তু 40%~60%, এবং GC বিষয়বস্তু এবং এক জোড়া প্রাইমারের Tm মান সমন্বয় করা উচিত।প্রাইমারে গুরুতর GC বা AT প্রবণতা থাকলে, প্রাইমারের 5' প্রান্তে উপযুক্ত পরিমাণে A, T বা G এবং C টেইল যোগ করা যেতে পারে।
3. অ্যানিলিং তাপমাত্রা
অ্যানিলিং তাপমাত্রা আনচেইন তাপমাত্রার চেয়ে 5 ℃ কম হওয়া উচিত।প্রাইমার বেসের সংখ্যা কম হলে, অ্যানিলিং তাপমাত্রা যথাযথভাবে বাড়ানো যেতে পারে, যা পিসিআর-এর নির্দিষ্টতা বাড়াতে পারে।ঘাঁটির সংখ্যা বড় হলে, অ্যানিলিং তাপমাত্রা যথাযথভাবে হ্রাস করা যেতে পারে।4℃ ~ 6℃ এর এক জোড়া প্রাইমারের মধ্যে অ্যানিলিং তাপমাত্রার পার্থক্য PCR ফলনকে প্রভাবিত করবে না, তবে আদর্শভাবে এক জোড়া প্রাইমারের অ্যানিলিং তাপমাত্রা একই, যা 55℃ ~ 75℃ এর মধ্যে পরিবর্তিত হতে পারে।
4. পরিবর্ধন টেমপ্লেটের গৌণ গঠন এলাকা এড়িয়ে চলুন
পরিবর্ধিত খণ্ডটি নির্বাচন করার সময় টেমপ্লেটের গৌণ কাঠামোর অঞ্চলটি এড়ানো ভাল।লক্ষ্য খণ্ডের স্থিতিশীল গৌণ কাঠামো প্রাসঙ্গিক কম্পিউটার সফ্টওয়্যার দ্বারা পূর্বাভাস এবং অনুমান করা যেতে পারে, যা টেমপ্লেট নির্বাচনের জন্য সহায়ক।পরীক্ষামূলক ফলাফল দেখায় যে সম্প্রসারণ প্রায়শই ব্যর্থ হয় যখন সম্প্রসারণ করা অঞ্চলের মুক্ত শক্তি (△G) 58.6lkJ/mol এর কম হয়।
5. লক্ষ্য ডিএনএর সাথে অমিল
যখন পরিবর্ধিত লক্ষ্য ডিএনএ ক্রম বড় হয়, তখন একটি প্রাইমার লক্ষ্য ডিএনএর একাধিক অংশে আবদ্ধ হতে পারে, ফলে ফলাফলে একাধিক ব্যান্ড দেখা যায়।এই সময় ব্লাস্ট সফটওয়্যার টেস্টিং ব্যবহার করতে হবে, ওয়েবসাইট:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.সারিবদ্ধ দুটি ক্রম নির্বাচন করুন (bl2seq)।
জোন 1 এ প্রাইমার সিকোয়েন্স পেস্ট করা এবং জোন 2 এ টার্গেট ডিএনএ সিকোয়েন্সগুলি বিনিময়যোগ্য, এবং BLAST পরিপূরক, অ্যান্টিসেন্স এবং অন্যান্য সম্ভাবনাগুলি গণনা করে, তাই ব্যবহারকারীদের লক্ষ্য করার দরকার নেই যে উভয় চেইনই সেন্স চেইন কিনা।আপনি যদি ডাটাবেসের সিকোয়েন্সের জিআই নম্বর জানেন তবে আপনি জিআই নম্বরও লিখতে পারেন, তাই আপনাকে ক্রমটির একটি বড় অংশ পেস্ট করতে হবে না।অবশেষে, প্রাইমারের লক্ষ্য ডিএনএ-তে একাধিক সমজাতীয় সাইট আছে কিনা তা দেখতে 3 এ সারিবদ্ধ ক্লিক করুন।
6. প্রাইমার টার্মিনাল
প্রাইমারের 3' প্রান্তটি যেখানে এক্সটেনশন শুরু হয়, তাই সেখানে শুরু হওয়া থেকে অমিল প্রতিরোধ করা গুরুত্বপূর্ণ।3' শেষটি পরপর 3 টির বেশি G বা C হওয়া উচিত নয়, কারণ এর ফলে প্রাইমারটি G+C সমৃদ্ধকরণ ক্রম অঞ্চলে ভুলভাবে ট্রিগার হয়ে যাবে।3' প্রান্ত কোনো গৌণ কাঠামো তৈরি করতে পারে না, বিশেষ PCR (AS-PCR) বিক্রিয়া ছাড়া, প্রাইমারের 3′ প্রান্তটি অমিল হতে পারে না।উদাহরণস্বরূপ, যদি এনকোডিং অঞ্চলটি প্রশস্ত করা হয়, তাহলে কোডনের তৃতীয় অবস্থানে প্রাইমারের 3' প্রান্তটি বন্ধ করা উচিত নয়, কারণ কোডনের তৃতীয় অবস্থানটি অবক্ষয় প্রবণ, যা পরিবর্ধনের নির্দিষ্টতা এবং দক্ষতাকে প্রভাবিত করবে।অ্যানেক্সেশন প্রাইমার ব্যবহার করার সময়, কোডন ব্যবহারের টেবিলটি পড়ুন, জৈবিক পছন্দের দিকে মনোযোগ দিন, 3′ প্রান্তে অ্যানেক্সেশন প্রাইমার ব্যবহার করবেন না এবং প্রাইমারের উচ্চ ঘনত্ব (1uM-3uM) ব্যবহার করুন।
7. প্রাইমারের সেকেন্ডারি স্ট্রাকচার
প্রাইমারগুলির নিজেরাই পরিপূরক ক্রম থাকা উচিত নয়, অন্যথায় প্রাইমারগুলি নিজেই হেয়ারপিনের কাঠামোতে ভাঁজ হয়ে যাবে এবং এই গৌণ কাঠামো স্টেরিক বাধার কারণে প্রাইমার এবং টেমপ্লেটগুলির বাঁধনকে প্রভাবিত করবে।যদি কৃত্রিম বিচার ব্যবহার করা হয়, তাহলে প্রাইমারগুলির ক্রমাগত পরিপূরক ভিত্তিগুলি 3bp-এর বেশি হওয়া উচিত নয়।দুটি প্রাইমারের মধ্যে কোনো পরিপূরকতা থাকা উচিত নয়, বিশেষ করে 3' প্রান্তের পরিপূরক ওভারল্যাপ এড়ানো উচিত যাতে প্রাইমার ডাইমার তৈরি না হয়।সাধারণভাবে, একটি জোড়া প্রাইমারের মধ্যে পরপর 4টির বেশি বেস হোমোলজি বা পরিপূরকতা থাকা উচিত নয়।
8. মার্কার বা লোকি যোগ করুন
5' শেষের পরিবর্ধনের নির্দিষ্টতার উপর সামান্য প্রভাব রয়েছে এবং তাই পরিবর্ধনের নির্দিষ্টতাকে প্রভাবিত না করেই পরিবর্তন করা যেতে পারে।প্রাইমার 5 'শেষের পরিবর্তন অন্তর্ভুক্ত: এনজাইম সীমাবদ্ধতা সাইট যোগ করা;লেবেলযুক্ত বায়োটিন, ফ্লুরোসেন্স, ডিগক্সিন, Eu3+ ইত্যাদি। প্রোটিন বাইন্ডিং ডিএনএ সিকোয়েন্স প্রবর্তন করে;মিউটেশন সাইট প্রবর্তন করা, মিউটেশন সিকোয়েন্স ঢোকানো এবং মিস করা এবং প্রোমোটার সিকোয়েন্স প্রবর্তন করা ইত্যাদি। অতিরিক্ত বেস কমবেশি অ্যামপ্লিফিকেশনের দক্ষতাকে প্রভাবিত করবে এবং প্রাইমার ডাইমার গঠনের সম্ভাবনা বাড়িয়ে দেবে, তবে পরবর্তী ধাপের জন্য কিছু ছাড় দিতে হবে।অতিরিক্ত সিকোয়েন্স যা টার্গেট সিকোয়েন্সে বিদ্যমান নেই, যেমন সীমাবদ্ধতা সাইট এবং প্রমোটার সিকোয়েন্স, নির্দিষ্টতা প্রভাবিত না করেই প্রাইমারের 5′ প্রান্তে যোগ করা যেতে পারে।এই ক্রমগুলি প্রাইমার টিএম মানগুলির গণনার মধ্যে অন্তর্ভুক্ত নয়, তবে পরিপূরকতা এবং অভ্যন্তরীণ গৌণ কাঠামোর জন্য পরীক্ষা করা উচিত।
9. সাবক্লোন
বেশিরভাগ সময়, পিসিআর শুধুমাত্র প্রাথমিক ক্লোনিং হয়, এবং তারপরে আমাদের লক্ষ্য খণ্ডটিকে বিভিন্ন ভেক্টরে সাবক্লোন করতে হবে, তাই আমাদের পিসিআর ধাপে পরবর্তী অপারেশনের জন্য অতিরিক্ত বেস ডিজাইন করতে হবে।
সাবক্লোনিংয়ের জন্য ডিজাইন করা কিছু ক্রম নীচে সংক্ষিপ্ত করা হয়েছে।
সীমাবদ্ধতা endonuclease সীমাবদ্ধতা সাইট যোগ করা হয়েছে
এনজাইম সীমাবদ্ধতা সাইট যোগ করা হচ্ছে PCR পণ্য সাবক্লোন করার জন্য সবচেয়ে বেশি ব্যবহৃত পদ্ধতি।সাধারণত, ক্লিভেজ সাইট ছয় ঘাঁটি, 5 'শেষ ছাড়াও বিভাজক সাইট 2 ~ 3 প্রতিরক্ষামূলক ঘাঁটি যোগ করতে হবে।যাইহোক, বিভিন্ন এনজাইম দ্বারা প্রয়োজনীয় প্রতিরক্ষামূলক ঘাঁটির সংখ্যা ভিন্ন।উদাহরণস্বরূপ, SalⅠ এর কোন প্রতিরক্ষামূলক বেস প্রয়োজন নেই, EcoRⅤ এর জন্য 1টি প্রতিরক্ষামূলক বেস প্রয়োজন, NotⅠ এর জন্য 2টি প্রতিরক্ষামূলক বেস প্রয়োজন, এবং Hind Ⅲ এর জন্য 3টি প্রতিরক্ষামূলক বেস প্রয়োজন৷
এলআইসি লেজ যোগ করে
LIC-এর পুরো নাম হল Ligation-Independent ক্লোনিং, একটি ক্লোনিং পদ্ধতি যা Navogen দ্বারা বিশেষভাবে PET ভেক্টরের অংশের জন্য উদ্ভাবিত হয়েছিল।এলআইসি পদ্ধতি দ্বারা প্রস্তুত করা পিইটি ক্যারিয়ারে অ-পরিপূরক 12-15 বেস একক স্ট্র্যান্ড স্টিকি প্রান্ত রয়েছে, যা লক্ষ্য সন্নিবেশ টুকরার সাথে সম্পর্কিত স্টিকি প্রান্তগুলির পরিপূরক।পরিবর্ধনের উদ্দেশ্যে, ঢোকানো খণ্ডটির প্রাইমার 5′ ক্রম LIC ভেক্টরের পরিপূরক হওয়া উচিত।T4 DNA পলিমারেজের 3′→5′ এক্সট্রানেক্ট অ্যাক্টিভিটি অল্প সময়ের পরে ঢোকানো টুকরোটির উপর একটি একক স্ট্র্যান্ড স্টিকি প্রান্ত তৈরি করতে পারে।যেহেতু পণ্যটি শুধুমাত্র প্রস্তুত সন্নিবেশ টুকরো এবং ভেক্টরের পারস্পরিক অ্যানিলিং থেকে গঠিত হতে পারে, এই পদ্ধতিটি খুব দ্রুত এবং দক্ষ, এবং এটি নির্দেশিত ক্লোনিং।
নির্দেশিত TA ক্লোন যোগ পুচ্ছ
TA ক্লোনিং একটি ভেক্টরে খণ্ডটিকে লক্ষ্য করতে অক্ষম ছিল, তাই পরে ইনভিট্রোজেন একটি ভেক্টর চালু করেছিল যা ক্লোনিংকে লক্ষ্য করতে পারে, যার এক প্রান্তে চারটি বিশিষ্ট বেস GTGGS রয়েছে।অতএব, পিসিআর প্রাইমারগুলির নকশায়, পরিপূরক ক্রমগুলি সেই অনুযায়ী যোগ করা উচিত, যাতে টুকরোগুলি "অভিমুখী" হতে পারে।
যদি আপনার সময় কম হয়, তাহলে আপনি সরাসরি সংশ্লেষণের চেষ্টা করতে পারেন, ভেক্টরের সাথে জিনকে একত্রিত করে, যাকে আমরা মিউজুলারিস্টদের মধ্যে ET জিন সংশ্লেষণ বলি।
D. ইন-ফিউশন ক্লোনিং পদ্ধতি
কোন ligase প্রয়োজন নেই, কোন দীর্ঘ প্রতিক্রিয়া প্রয়োজন.যতক্ষণ না প্রাইমারের ডিজাইনে লিনিয়ারাইজড ভেক্টরের উভয় প্রান্তে একটি সিকোয়েন্স চালু করা হয়, ততক্ষণ পর্যন্ত পিসিআর প্রোডাক্ট এবং লিনিয়ারাইজড ভেক্টর বিএসএ ধারণকারী ইন-ফিউশন এনজাইম দ্রবণে যোগ করা হয় এবং ঘরের তাপমাত্রায় আধা ঘন্টার জন্য রাখা হয়, রূপান্তরটি সঞ্চালিত হতে পারে।এই পদ্ধতি বড় ভলিউম রূপান্তর জন্য বিশেষভাবে উপযুক্ত.
10. প্রাইমার মার্জ করুন
কখনও কখনও, প্রাইমার ডিজাইন সম্পর্কে শুধুমাত্র সীমিত ক্রম তথ্য জানা যায়।উদাহরণস্বরূপ, যদি শুধুমাত্র অ্যামিনো অ্যাসিডের ক্রমটি জানা যায়, তাহলে মার্জিং প্রাইমারটি ডিজাইন করা যেতে পারে।একটি মার্জার প্রাইমার হল বিভিন্ন ক্রমগুলির একটি মিশ্রণ যা একটি একক অ্যামিনো অ্যাসিডকে এনকোড করে এমন সমস্ত বিভিন্ন ভিত্তি সম্ভাবনার প্রতিনিধিত্ব করে।নির্দিষ্টতা বাড়ানোর জন্য, আপনি বিভিন্ন জীবের বেস ব্যবহারের পছন্দ অনুযায়ী সংযোজন কমাতে কোডন ব্যবহারের টেবিলটি উল্লেখ করতে পারেন।প্রাইমারের অ্যানিলিং তাপমাত্রা কমাতে হাইপক্সানথাইনকে সমস্ত ঘাঁটির সাথে যুক্ত করা যেতে পারে।প্রাইমারের 3′ প্রান্তে সংযুক্ত ঘাঁটিগুলি ব্যবহার করবেন না কারণ 3′ প্রান্তে শেষ 3টি ঘাঁটির অ্যানিলিং ভুল সাইটে PCR শুরু করার জন্য যথেষ্ট।উচ্চতর প্রাইমার ঘনত্ব (1μM থেকে 3μM) ব্যবহার করা হয় কারণ অনেক সংযুক্তি মিশ্রণের প্রাইমারগুলি লক্ষ্য টেমপ্লেটের জন্য নির্দিষ্ট নয়।
পিসিআর কাঁচামালনিয়ন্ত্রণ
1. প্রাইমার পরিমাণ
প্রতিটি প্রাইমারের ঘনত্ব 0.1 ~ 1umol বা 10 ~ 100pmol।প্রাইমারের সর্বনিম্ন পরিমাণের সাথে প্রয়োজনীয় ফলাফল তৈরি করা ভাল।প্রাইমারের উচ্চ ঘনত্ব অমিল এবং অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন ঘটাবে এবং প্রাইমারগুলির মধ্যে ডাইমার গঠনের সম্ভাবনা বাড়িয়ে তুলবে।
2. প্রাইমার ঘনত্ব
প্রাইমারের ঘনত্ব নির্দিষ্টতাকে প্রভাবিত করে।সর্বোত্তম প্রাইমার ঘনত্ব সাধারণত 0.1 এবং 0.5μM এর মধ্যে হয়।উচ্চতর প্রাইমার ঘনত্ব অনির্দিষ্ট পণ্যের পরিবর্ধনের দিকে পরিচালিত করে।
3. প্রাইমারের অ্যানিলিং তাপমাত্রা
প্রাইমারগুলির জন্য আরেকটি গুরুত্বপূর্ণ পরামিতি হল গলানো তাপমাত্রা (Tm)।এটি সেই তাপমাত্রা যখন প্রাইমারের 50% এবং পরিপূরক ক্রমগুলিকে ডবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ অণু হিসাবে উপস্থাপন করা হয়।পিসিআর অ্যানিলিং তাপমাত্রা সেট করতে Tm প্রয়োজন।আদর্শভাবে, অ্যানিলিং তাপমাত্রা লক্ষ্য ক্রম সহ প্রাইমারগুলির কার্যকর অ্যানিলিং নিশ্চিত করার জন্য যথেষ্ট কম, তবে অ-নির্দিষ্ট বাঁধাই কমাতে যথেষ্ট উচ্চ।55℃ থেকে 70℃ পর্যন্ত যুক্তিসঙ্গত অ্যানিলিং তাপমাত্রা।অ্যানিলিং তাপমাত্রা সাধারণত প্রাইমারের Tm থেকে 5℃ কম সেট করা হয়।
Tm সেট করার জন্য বেশ কয়েকটি সূত্র রয়েছে, যা ব্যবহৃত সূত্র এবং প্রাইমারের ক্রম অনুসারে ব্যাপকভাবে পরিবর্তিত হয়।যেহেতু বেশিরভাগ সূত্র একটি আনুমানিক Tm মান প্রদান করে, সমস্ত অ্যানিলিং তাপমাত্রা শুধুমাত্র একটি সূচনা বিন্দু।বিভিন্ন প্রতিক্রিয়া বিশ্লেষণ করে নির্দিষ্টতা উন্নত করা যেতে পারে যা ক্রমান্বয়ে অ্যানিলিং তাপমাত্রা বাড়ায়।আনুমানিক Tm-5℃ এর নিচে শুরু করুন এবং ধীরে ধীরে 2℃ বৃদ্ধিতে অ্যানিলিং তাপমাত্রা বাড়ান।উচ্চ অ্যানিলিং তাপমাত্রা প্রাইমার ডাইমার এবং অ-নির্দিষ্ট পণ্যের গঠন হ্রাস করবে।সেরা ফলাফলের জন্য, দুটি প্রাইমারের আনুমানিক Tm মান থাকা উচিত।যদি প্রাইমার জোড়ার Tm পার্থক্য 5℃-এর বেশি হয়, তাহলে প্রাইমারগুলি চক্রে কম অ্যানিলিং তাপমাত্রা ব্যবহার করে একটি উল্লেখযোগ্য মিথ্যা শুরু দেখাবে।দুটি প্রাইমার Tm ভিন্ন হলে, সর্বনিম্ন Tm থেকে 5℃ কম অ্যানিলিং তাপমাত্রা সেট করুন।বিকল্পভাবে, নির্দিষ্টতা বাড়ানোর জন্য, উচ্চতর Tm-এর জন্য ডিজাইন করা অ্যানিলিং তাপমাত্রায় প্রথমে পাঁচটি চক্র সঞ্চালিত হতে পারে, তারপরে নিম্ন Tm-এর জন্য ডিজাইন করা অ্যানিলিং তাপমাত্রায় অবশিষ্ট চক্রগুলি অনুসরণ করা যেতে পারে।এটি আঁটসাঁট পরিস্থিতিতে গন্তব্য টেমপ্লেটের একটি আংশিক অনুলিপি প্রাপ্ত করার অনুমতি দেয়।
4. প্রাইমার বিশুদ্ধতা এবং স্থায়িত্ব
কাস্টম প্রাইমারের আদর্শ বিশুদ্ধতা বেশিরভাগ পিসিআর অ্যাপ্লিকেশনের জন্য পর্যাপ্ত।ডিসল্টিংয়ের মাধ্যমে বেনজয়াইল এবং আইসোবিউটাইল গ্রুপগুলি অপসারণ করা ন্যূনতম এবং তাই পিসিআর-এ হস্তক্ষেপ করে না।কিছু অ্যাপ্লিকেশানের সংশ্লেষণ প্রক্রিয়ায় কোনো অ-পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের ক্রম অপসারণের জন্য পরিশোধন প্রয়োজন।ডিএনএ সংশ্লেষণ রসায়নের কার্যকারিতা 100% না হওয়ার কারণে এই ছোট ক্রমগুলি ঘটে।এটি একটি বৃত্তাকার প্রক্রিয়া যা বারবার রাসায়নিক বিক্রিয়া ব্যবহার করে কারণ প্রতিটি বেস 3′ থেকে 5′ পর্যন্ত DNA তৈরি করতে যোগ করা হয়।আপনি উভয় চক্রে ব্যর্থ হতে পারেন.লম্বা প্রাইমার, বিশেষ করে যেগুলি 50 টির বেশি ঘাঁটিগুলির মধ্যে রয়েছে, সেগুলির একটি বড় অনুপাত ছেঁটে যাওয়া সিকোয়েন্স রয়েছে এবং এর জন্য বিশুদ্ধকরণের প্রয়োজন হতে পারে।
প্রাইমারের ফলন সিন্থেটিক কেমিস্ট্রি এবং পরিশোধন পদ্ধতির দক্ষতার দ্বারা প্রভাবিত হয়।বায়োফার্মাসিউটিক্যাল কোম্পানি, যেমন সাইটোলজি এবং শেংগং, সবাই অলিগোনিউক্লিওসাইডের মোট আউটপুট নিশ্চিত করতে একটি ন্যূনতম OD ইউনিট ব্যবহার করে।কাস্টম প্রাইমারগুলি শুকনো পাউডার আকারে পাঠানো হয়।TE-তে প্রাইমারগুলি পুনরায় দ্রবীভূত করা ভাল যাতে চূড়ান্ত ঘনত্ব 100μM হয়।ডিওনাইজড জলের চেয়ে TE ভাল কারণ জলের pH প্রায়শই অম্লীয় হয় এবং অলিগোনিউক্লিওসাইডের হাইড্রোলাইসিস ঘটায়।
প্রাইমারগুলির স্থিতিশীলতা স্টোরেজ অবস্থার উপর নির্ভর করে।শুকনো পাউডার এবং দ্রবীভূত প্রাইমার -20℃ এ সংরক্ষণ করা উচিত।10μM-এর বেশি ঘনত্বে TE-তে দ্রবীভূত প্রাইমারগুলি স্থিরভাবে -20℃-এ 6 মাসের জন্য সংরক্ষণ করা যেতে পারে, কিন্তু শুধুমাত্র 1 সপ্তাহের কম সময়ের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় (15℃ থেকে 30℃) সংরক্ষণ করা যেতে পারে।শুকনো পাউডার প্রাইমার কমপক্ষে 1 বছরের জন্য -20 সেন্টিগ্রেডে এবং ঘরের তাপমাত্রায় (15 সেন্টিগ্রেড থেকে 30 সেন্টিগ্রেড) 2 মাস পর্যন্ত সংরক্ষণ করা যেতে পারে।
5. এনজাইম এবং তাদের ঘনত্ব
বর্তমানে, ব্যবহৃত Taq DNA পলিমারেজ মূলত কলিফর্ম ব্যাকটেরিয়া দ্বারা সংশ্লেষিত জিন ইঞ্জিনিয়ারিং এনজাইম।একটি সাধারণ পিসিআর প্রতিক্রিয়া অনুঘটক করার জন্য প্রয়োজনীয় এনজাইমের পরিমাণ প্রায় 2.5U (100ul এর মোট প্রতিক্রিয়ার পরিমাণকে বোঝায়)।ঘনত্ব খুব বেশি হলে, এটি অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনের দিকে নিয়ে যেতে পারে;যদি ঘনত্ব খুব কম হয়, সিন্থেটিক পণ্যের পরিমাণ হ্রাস করা হবে।
6. dNTP এর গুণমান এবং ঘনত্ব
ডিএনটিপির গুণমান ঘনত্ব এবং পিসিআর পরিবর্ধনের দক্ষতার সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত।dNTP পাউডার দানাদার, এবং এটির পরিবর্তনশীলতা তার জৈবিক কার্যকলাপ হারায় যদি এটি ভুলভাবে সংরক্ষণ করা হয়।dNTP দ্রবণটি অম্লীয়, এবং উচ্চ ঘনত্বে ব্যবহার করা উচিত, 1M NaOH বা 1M Tris.HCL বাফার দ্রবণ এর PH 7.0 ~ 7.5 এ সামঞ্জস্য করতে, অল্প পরিমাণ সাব-প্যাকেজিং, -20℃ এ হিমায়িত স্টোরেজ।একাধিক ফ্রিজ-গলানো dNTP ক্ষয় করবে।PCR বিক্রিয়ায়, dNTP 50 ~ 200umol/L হওয়া উচিত।বিশেষ করে, চারটি ডিএনটিপিএসের ঘনত্বের দিকে মনোযোগ দেওয়া উচিত সমান (সমান মোল প্রস্তুতি)।যদি তাদের মধ্যে যেকোনো একটির ঘনত্ব অন্যদের (উচ্চ বা নিম্ন) থেকে আলাদা হয় তবে অমিল হবে।খুব কম ঘনত্ব পিসিআর পণ্যের ফলন হ্রাস করবে।dNTP Mg2+ এর সাথে একত্রিত হতে পারে এবং বিনামূল্যে Mg2+ এর ঘনত্ব কমাতে পারে।
7. টেমপ্লেট (টার্গেট জিন) নিউক্লিক অ্যাসিড
টেমপ্লেট নিউক্লিক অ্যাসিডের পরিমাণ এবং পরিশোধন ডিগ্রী পিসিআর-এর সাফল্য বা ব্যর্থতার মূল লিঙ্কগুলির মধ্যে একটি।ঐতিহ্যগত ডিএনএ পরিশোধন পদ্ধতি সাধারণত SDS এবং প্রোটিজ কে ব্যবহার করে নমুনাগুলি হজম এবং নিষ্পত্তি করতে।এসডিএস-এর প্রধান কাজগুলি হল: কোষের ঝিল্লিতে লিপিড এবং প্রোটিনগুলিকে দ্রবীভূত করা, এইভাবে ঝিল্লি প্রোটিনগুলিকে দ্রবীভূত করে কোষের ঝিল্লিকে ধ্বংস করে, এবং কোষে নিউক্লিয়ার প্রোটিনগুলিকে বিচ্ছিন্ন করে, এসডিএসও প্রোটিনের সাথে একত্রিত হতে পারে এবং অবক্ষেপণ করতে পারে;প্রোটিজ কে প্রোটিনগুলিকে হাইড্রোলাইজ করতে এবং হজম করতে পারে, বিশেষ করে ডিএনএর সাথে আবদ্ধ হিস্টোনগুলি, এবং তারপর প্রোটিন এবং অন্যান্য কোষের উপাদানগুলি নিষ্কাশন করতে জৈব দ্রাবক ফেনল এবং ক্লোরোফর্ম ব্যবহার করতে পারে এবং নিউক্লিক অ্যাসিডকে প্ররোচিত করতে ইথানল বা আইসোপ্রোপাইল অ্যালকোহল ব্যবহার করতে পারে।নিষ্কাশিত নিউক্লিক অ্যাসিড পিসিআর প্রতিক্রিয়াগুলির জন্য একটি টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে।সাধারণ ক্লিনিকাল সনাক্তকরণের নমুনার জন্য, একটি দ্রুত এবং সহজ পদ্ধতি কোষ দ্রবীভূত করতে, লাইসেট প্যাথোজেন, হজম এবং ক্রোমোজোম থেকে মুক্ত লক্ষ্য জিনে প্রোটিন অপসারণ করতে এবং সরাসরি পিসিআর পরিবর্ধনের জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে।আরএনএ টেমপ্লেট নিষ্কাশন সাধারণত গুয়ানিডিন আইসোথিওসায়ানেট বা প্রোটিজ কে পদ্ধতি ব্যবহার করে আরএনএকে অবনতি থেকে বিরত রাখতে।
8.Mg2+ ঘনত্ব
Mg2+ PCR পরিবর্ধনের নির্দিষ্টতা এবং ফলনের উপর উল্লেখযোগ্য প্রভাব ফেলে।সাধারণ PCR প্রতিক্রিয়ায়, যখন বিভিন্ন dNTP-এর ঘনত্ব 200umol/L হয়, তখন Mg2+ এর উপযুক্ত ঘনত্ব হল 1.5 ~ 2.0mmol/L।Mg2+ ঘনত্ব খুব বেশি, প্রতিক্রিয়ার সুনির্দিষ্টতা হ্রাস পায়, অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন ঘটে, খুব কম ঘনত্ব Taq DNA পলিমারেজের কার্যকলাপকে হ্রাস করবে, যার ফলে প্রতিক্রিয়া পণ্যগুলি হ্রাস পাবে।
ম্যাগনেসিয়াম আয়নগুলি পিসিআর-এর বিভিন্ন দিককে প্রভাবিত করে, যেমন ডিএনএ পলিমারেজ কার্যকলাপ, যা ফলনকে প্রভাবিত করে;আরেকটি উদাহরণ হল প্রাইমার অ্যানিলিং, যা নির্দিষ্টতাকে প্রভাবিত করে।dNTP এবং টেমপ্লেট ম্যাগনেসিয়াম আয়নের সাথে আবদ্ধ হয়, এনজাইম কার্যকলাপের জন্য প্রয়োজনীয় ফ্রি ম্যাগনেসিয়াম আয়নের পরিমাণ হ্রাস করে।বিভিন্ন প্রাইমার জোড়া এবং টেমপ্লেটের জন্য সর্বোত্তম ম্যাগনেসিয়াম আয়ন ঘনত্ব পরিবর্তিত হয়, তবে 200μM dNTP-এর সাথে একটি সাধারণ PCR শুরু হওয়া ঘনত্ব হল 1.5mM (দ্রষ্টব্য: রিয়েল-টাইম পরিমাণগত PCR-এর জন্য, একটি ফ্লুরোসেন্ট প্রোবের সাথে 3 থেকে 5mM ম্যাগনেসিয়াম আয়ন দ্রবণ ব্যবহার করুন)।ফ্রি ম্যাগনেসিয়াম আয়নগুলির উচ্চতর ঘনত্ব ফলন বাড়ায়, তবে অনির্দিষ্ট পরিবর্ধন বৃদ্ধি করে এবং বিশ্বস্ততা হ্রাস করে।সর্বোত্তম ঘনত্ব নির্ধারণ করতে, ম্যাগনেসিয়াম আয়ন টাইট্রেশনগুলি 0.5 মিমি বৃদ্ধিতে 1 মিমি থেকে 3 মিমি পর্যন্ত সঞ্চালিত হয়েছিল।ম্যাগনেসিয়াম আয়ন অপ্টিমাইজেশানের উপর নির্ভরতা কমাতে, প্লাটিনাম টাক ডিএনএ পলিমারেজ ব্যবহার করা যেতে পারে।প্ল্যাটিনাম টাক ডিএনএ পলিমারেজ ট্যাক ডিএনএ পলিমারেজের চেয়ে বিস্তৃত ম্যাগনেসিয়াম আয়ন ঘনত্বের উপর ফাংশন বজায় রাখতে সক্ষম এবং তাই কম অপ্টিমাইজেশন প্রয়োজন।
9. পিসিআর-প্রমোটিং অ্যাডিটিভস
অ্যানিলিং তাপমাত্রা, প্রাইমার ডিজাইন এবং ম্যাগনেসিয়াম আয়ন ঘনত্বের অপ্টিমাইজেশন বেশিরভাগ টেমপ্লেটের অত্যন্ত নির্দিষ্ট পরিবর্ধনের জন্য যথেষ্ট;যাইহোক, উচ্চ GC বিষয়বস্তু সহ কিছু টেমপ্লেটের জন্য অতিরিক্ত ব্যবস্থার প্রয়োজন।ডিএনএ-এর গলে যাওয়া তাপমাত্রাকে প্রভাবিত করে এমন সংযোজনগুলি পণ্যের নির্দিষ্টতা এবং ফলন উন্নত করার আরেকটি উপায় প্রদান করে।সেরা ফলাফলের জন্য টেমপ্লেটটির সম্পূর্ণ বিকৃতকরণ প্রয়োজন।
উপরন্তু, গৌণ গঠন প্রাইমার বাঁধাই এবং এনজাইম এক্সটেনশন প্রতিরোধ করে।
ফরমামাইড, ডিএমএসও, গ্লিসারিন, বিটেইন এবং পিসিআরএক্স এনহ্যান্সার সলিউশন সহ পিসিআর অ্যাডিটিভগুলি পরিবর্ধন বাড়ায়।তাদের সম্ভাব্য প্রক্রিয়া হল গলে যাওয়া তাপমাত্রা কমানো, এইভাবে প্রাইমারের অ্যানিলিংকে সাহায্য করে এবং সেকেন্ডারি কাঠামো অঞ্চলের মাধ্যমে ডিএনএ পলিমারেজ এক্সটেনশনে সহায়তা করে।PCRx সলিউশনের অন্যান্য সুবিধা রয়েছে।প্ল্যাটিনাম টাক ডিএনএ পলিমারেজ এবং প্ল্যাটিনাম পিএফএক্স ডিএনএ পলিমারেজের সাথে ব্যবহার করার সময় ন্যূনতম ম্যাগনেসিয়াম আয়ন অপ্টিমাইজেশন প্রয়োজন।এইভাবে, তৃতীয় পদ্ধতি, ম্যাগনেসিয়াম আয়ন অপ্টিমাইজেশনের নির্ভরতা হ্রাস করার সময় নির্দিষ্টতা বাড়ানোর জন্য প্ল্যাটিনাম কৌশলটি সংযোজনের সাথে মিলিত হয়।সর্বোত্তম ফলাফলের জন্য, অ্যাডিটিভের ঘনত্ব অপ্টিমাইজ করা উচিত, বিশেষ করে DMSO, ফরমামাইড এবং গ্লিসারল, যা Taq DNA পলিমারেজকে বাধা দেয়।
10. হট স্টার্ট
ভাল প্রাইমার ডিজাইনের পাশাপাশি পিসিআর নির্দিষ্টতা উন্নত করার জন্য হট স্টার্ট পিসিআর অন্যতম গুরুত্বপূর্ণ পদ্ধতি।যদিও Taq DNA পলিমারেজের সর্বোত্তম প্রসারণ তাপমাত্রা 72℃, পলিমারেজ ঘরের তাপমাত্রায় সক্রিয় থাকে।এইভাবে, অ-নির্দিষ্ট পণ্যগুলি উত্পাদিত হয় যখন পিসিআর প্রতিক্রিয়া তৈরির সময় এবং তাপচক্রের শুরুতে ধারণ তাপমাত্রা অ্যানিলিং তাপমাত্রার চেয়ে কম হয়।একবার গঠিত হলে, এই অনির্দিষ্ট পণ্যগুলি কার্যকরভাবে প্রসারিত হয়।হট-স্টার্ট পিসিআর বিশেষভাবে কার্যকর হয় যখন প্রাইমার ডিজাইনের জন্য ব্যবহৃত সাইটগুলি জেনেটিক উপাদানগুলির অবস্থান দ্বারা সীমাবদ্ধ থাকে, যেমন সাইট-নির্দেশিত মিউটেশন, এক্সপ্রেশন ক্লোনিং, বা ডিএনএ ইঞ্জিনিয়ারিংয়ের জন্য ব্যবহৃত জেনেটিক উপাদানগুলির নির্মাণ এবং হেরফের।
টাক ডিএনএ পলিমারেজের কার্যকলাপকে সীমিত করার একটি সাধারণ পদ্ধতি হল বরফের উপর পিসিআর প্রতিক্রিয়া দ্রবণ প্রস্তুত করা এবং এটিকে একটি প্রিহিটেড পিসিআর যন্ত্রপাতিতে রাখা।এই পদ্ধতিটি সহজ এবং সস্তা, তবে এটি এনজাইমের কার্যকলাপ সম্পূর্ণ করে না এবং তাই অ-নির্দিষ্ট পণ্যগুলির পরিবর্ধনকে সম্পূর্ণরূপে নির্মূল করে না।
থার্মাল প্রাইমিং একটি অপরিহার্য উপাদানকে বাধা দিয়ে ডিএনএ সংশ্লেষণকে বিলম্বিত করে যতক্ষণ না পিসিআর যন্ত্রপাতি ডিনাচুরেশন তাপমাত্রায় পৌঁছায়।তাক ডিএনএ পলিমারেজের বিলম্বিত সংযোজন সহ বেশিরভাগ ম্যানুয়াল তাপীয় সূচনা পদ্ধতিগুলি জটিল, বিশেষত উচ্চ-থ্রুপুট অ্যাপ্লিকেশনগুলির জন্য।অন্যান্য তাপীয় প্রাইমিং পদ্ধতিগুলি ম্যাগনেসিয়াম আয়ন বা এনজাইম সহ একটি অপরিহার্য উপাদানকে আবদ্ধ করতে বা টেমপ্লেট এবং বাফারগুলির মতো প্রতিক্রিয়াশীল উপাদানগুলিকে শারীরিকভাবে বিচ্ছিন্ন করতে একটি মোমের ঢাল ব্যবহার করে।তাপচক্রের সময়, মোম গলে যাওয়ার সাথে সাথে বিভিন্ন উপাদান নির্গত হয় এবং একসাথে মিশ্রিত হয়।ম্যানুয়াল হট স্টার্ট পদ্ধতির মতো, মোমের ঢাল পদ্ধতিটি কষ্টকর এবং দূষণের ঝুঁকিপূর্ণ এবং উচ্চ থ্রুপুট অ্যাপ্লিকেশনের জন্য উপযুক্ত নয়।
প্ল্যাটিনাম ডিএনএ পলিমারেজ স্বয়ংক্রিয় হট স্টার্ট পিসিআরের জন্য সুবিধাজনক এবং দক্ষ।প্ল্যাটিনাম টাক ডিএনএ পলিমারেজ রিকম্বিন্যান্ট টাক ডিএনএ পলিমারেজ নিয়ে গঠিত যা তাক ডিএনএ পলিমারেজের বিরুদ্ধে মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডির সাথে মিলিত হয়।দীর্ঘক্ষণ তাপমাত্রা ধরে রাখার সময় এনজাইমের কার্যকলাপকে বাধা দেওয়ার জন্য পিসিআর দ্বারা অ্যান্টিবডি তৈরি করা হয়।Taq DNA পলিমারেজ সম্পূর্ণ পলিমারেজ ক্রিয়াকলাপ পুনরুদ্ধার করে, বিকৃতকরণ পদক্ষেপের 94℃ নিরোধকের সময় প্রতিক্রিয়াতে মুক্তি পেয়েছিল।তাপীয় সূচনার জন্য রাসায়নিকভাবে পরিবর্তিত Taq DNA পলিমারেজের বিপরীতে, প্ল্যাটিনাম এনজাইমকে পলিমারেজ সক্রিয় করতে 94℃ (10 থেকে 15 মিনিট) দীর্ঘ নিরোধকের প্রয়োজন হয় না।PlatinumTaq DNA পলিমারেজের সাথে, Taq DNA পলিমারেজ কার্যকলাপের 90% 2 মিনিট পরে 94℃ এ পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল।
11. নেস্ট-পিসিআর
নেস্টেড প্রাইমার ব্যবহার করে ক্রমাগত পরিবর্ধনের রাউন্ড নির্দিষ্টতা এবং সংবেদনশীলতা উন্নত করতে পারে।প্রথম রাউন্ডটি 15 থেকে 20 চক্রের একটি প্রমিত পরিবর্ধন।প্রাথমিক পরিবর্ধন পণ্যের একটি ছোট ভগ্নাংশ 100 থেকে 1000 বার পাতলা করা হয়েছিল এবং 15 থেকে 20 চক্রের জন্য পরিবর্ধনের দ্বিতীয় রাউন্ডে যোগ করা হয়েছিল।বিকল্পভাবে, প্রাথমিক পরিবর্ধিত পণ্য জেল পরিশোধন দ্বারা মাপ করা যেতে পারে।দ্বিতীয় রাউন্ডের পরিবর্ধনে একটি নেস্টেড প্রাইমার ব্যবহার করা হয়, যা প্রথম প্রাইমারের ভিতরে লক্ষ্য ক্রমের সাথে আবদ্ধ হতে পারে।নেস্টেড পিসিআর ব্যবহার একাধিক টার্গেট সাইটের পরিবর্ধনের সম্ভাবনাকে হ্রাস করে কারণ প্রাইমারের উভয় সেটের জন্য কয়েকটি লক্ষ্য ক্রম পরিপূরক রয়েছে।একই প্রাইমার সহ একই মোট সংখ্যক চক্র (30 থেকে 40) অনির্দিষ্ট সাইটগুলিকে বিবর্ধিত করেছে।নেস্টেড পিসিআর সীমিত লক্ষ্য ক্রমগুলির সংবেদনশীলতা বৃদ্ধি করে (যেমন, বিরল এমআরএনএস) এবং কঠিন পিসিআরএস (যেমন 5′ RACE) এর নির্দিষ্টতা উন্নত করে।
12. ডিসেন্ডিং পিসিআর
ডিসেন্ডিং পিসিআর পিসিআর-এর প্রথম কয়েকটি চক্রের জন্য টাইট অ্যানিলিং অবস্থা ব্যবহার করে নির্দিষ্টতা উন্নত করে।চক্রটি আনুমানিক Tm থেকে প্রায় 5℃ বেশি অ্যানিলিং তাপমাত্রায় শুরু হয়, তারপর প্রতিটি চক্র 1℃ থেকে 2℃ কমিয়ে আনা হয় যতক্ষণ না অ্যানিলিং তাপমাত্রা Tm 5℃-এর নিচে না হয়।শুধুমাত্র সর্বোচ্চ হোমোলজি সহ গন্তব্য টেমপ্লেটটি প্রশস্ত করা হবে।এই পণ্যগুলি পরবর্তী চক্রগুলিতে প্রসারিত হতে থাকে, পরিবর্ধিত অ-নির্দিষ্ট পণ্যগুলিকে ভিড় করে।ডিসেন্ডিং পিসিআর এমন পদ্ধতির জন্য উপযোগী যেখানে প্রাইমার এবং টার্গেট টেমপ্লেটের মধ্যে হোমোলজির ডিগ্রি জানা যায় না, যেমন AFLP DNA ফিঙ্গারপ্রিন্টিং।
সম্পর্কিত পিসিআর কিটস
2× পিসিআর হিরোTMমিক্স সিস্টেমের সাধারণ পিসিআর মিক্স সিস্টেমের তুলনায় পিসিআর ইনহিবিটরগুলির প্রতি উচ্চ সহনশীলতা রয়েছে এবং এটি বিভিন্ন জটিল টেমপ্লেটের পিসিআর পরিবর্ধনের সাথে সহজেই মানিয়ে নিতে পারে।অনন্য প্রতিক্রিয়া সিস্টেম এবং উচ্চ-দক্ষ Taq Hero PCR প্রতিক্রিয়াকে উচ্চতর পরিবর্ধন দক্ষতা, নির্দিষ্টতা এবং সংবেদনশীলতা তৈরি করে।
উচ্চতর পরিবর্ধন দক্ষতা
এটিতে 5'→3' ডিএনএ পলিমারেজ কার্যকলাপ এবং 5'→3' এক্সোনিউক্লিজ কার্যকলাপ রয়েছে, 3'→5' এক্সোনিউক্লিজ কার্যকলাপ ছাড়াই।
রিয়েল টাইম PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I কিট
নির্দিষ্ট-অপ্টিমাইজ করা বাফার এবং হট-স্টার্ট Taq এনজাইম অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন এবং প্রাইমার ডাইমার গঠন প্রতিরোধ করতে পারে
উচ্চ সংবেদনশীলতা-টেমপ্লেটের কম কপি সনাক্ত করতে পারে
কিটটি একটি অনন্য ফোরজিন রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন রিএজেন্ট এবং ফোরজিন হটস্টার টাক ডিএনএ পলিমারেজ ব্যবহার করে একটি অনন্য প্রতিক্রিয়া সিস্টেমের সাথে কার্যকরভাবে প্রতিক্রিয়ার পরিবর্ধন দক্ষতা এবং নির্দিষ্টতা উন্নত করতে।
পোস্টের সময়: মে-০৯-২০২৩
