一, প্রতিক্রিয়া সিস্টেমের সংবেদনশীলতা বৃদ্ধি:

1. উচ্চ মানের আরএনএ বিচ্ছিন্ন করুন:

সফল সিডিএনএ সংশ্লেষণ উচ্চ-মানের আরএনএ থেকে আসে।উচ্চ-মানের RNA কমপক্ষে পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের এবং বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজ ইনহিবিটর যেমন EDTA বা SDS মুক্ত হওয়া উচিত।RNA-এর গুণমান নির্ধারণ করে যে আপনি সিডিএনএ-তে প্রতিলিপি করতে পারেন এমন সর্বাধিক পরিমাণ সিকোয়েন্স তথ্য।একটি সাধারণ আরএনএ পরিশোধন পদ্ধতি হল গুয়ানিডিন আইসোথিওসায়ানেট/অ্যাসিড ফেনল ব্যবহার করে একটি এক-পদক্ষেপ পদ্ধতি।RNase-এর পরিমানে দূষণ রোধ করতে, RNase-সমৃদ্ধ নমুনা (যেমন অগ্ন্যাশয়) থেকে বিচ্ছিন্ন RNA কে ফর্মালডিহাইডে সংরক্ষণ করা প্রয়োজন যাতে উচ্চ মানের RNA সংরক্ষণ করা যায়, বিশেষ করে দীর্ঘমেয়াদী স্টোরেজের জন্য।ইঁদুরের লিভার থেকে আহরিত আরএনএ মূলত এক সপ্তাহ পানিতে সংরক্ষণ করার পর ক্ষয়প্রাপ্ত হয়, যেখানে ইঁদুরের প্লীহা থেকে আহরিত আরএনএ 3 বছর ধরে পানিতে সংরক্ষণ করার পর স্থিতিশীল থাকে।উপরন্তু, 4 kb-এর বেশি ট্রান্সক্রিপ্ট ছোট ট্রান্সক্রিপ্টের তুলনায় RNases দ্বারা ক্ষয়ক্ষতির জন্য বেশি সংবেদনশীল।সঞ্চিত আরএনএ নমুনার স্থায়িত্ব বাড়ানোর জন্য, আরএনএকে ডিওনাইজড ফরমামাইডে দ্রবীভূত করা যেতে পারে এবং -70 ডিগ্রি সেলসিয়াসে সংরক্ষণ করা যেতে পারে।আরএনএ সংরক্ষণের জন্য ব্যবহৃত ফরমামাইড অবশ্যই আরএনএ-অপমানকারী ধ্বংসাবশেষ মুক্ত হতে হবে।অগ্ন্যাশয় থেকে RNA অন্তত এক বছরের জন্য ফরমামাইডে সংরক্ষণ করা যেতে পারে।আরএনএ ব্যবহার করার প্রস্তুতি নেওয়ার সময়, আপনি আরএনএকে বর্জন করার জন্য নিম্নলিখিত পদ্ধতিটি ব্যবহার করতে পারেন: 0.2M-এ NaCl যোগ করুন এবং ইথানলের আয়তনের 4 গুণ, ঘরের তাপমাত্রায় 3-5 মিনিটের জন্য রাখুন এবং 5 মিনিটের জন্য 10,000×g এ সেন্ট্রিফিউজ করুন।

2. RNaseH- নিষ্ক্রিয় (RNaseH-) বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্ট ব্যবহার করুন:

CDNA সংশ্লেষণের দৈর্ঘ্য এবং ফলন বাড়াতে RNase ইনহিবিটরগুলি প্রায়ই বিপরীত প্রতিলিপি বিক্রিয়ায় যোগ করা হয়।একটি বাফার এবং একটি হ্রাসকারী এজেন্ট (যেমন DTT) এর উপস্থিতিতে প্রথম-স্ট্র্যান্ড সংশ্লেষণ প্রতিক্রিয়ার সময় RNase ইনহিবিটরগুলি যোগ করা উচিত, কারণ cDNA সংশ্লেষণের পূর্বের প্রক্রিয়াটি ইনহিবিটরকে ডিনেচার করে, যার ফলে আবদ্ধ RNase মুক্ত হয় যা RNA হ্রাস করতে পারে।প্রোটিন RNase ইনহিবিটরগুলি শুধুমাত্র RNase A, B, C দ্বারা RNA এর অবক্ষয় রোধ করে এবং ত্বকে RNase প্রতিরোধ করে না, তাই এই ইনহিবিটারগুলি ব্যবহার করা সত্ত্বেও আপনার আঙ্গুল থেকে RNase প্রবর্তন না করার বিষয়ে সতর্ক থাকুন।

রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ আরএনএকে সিডিএনএ-তে রূপান্তরকে অনুঘটক করে।M-MLV এবং AMV উভয়েরই নিজস্ব পলিমারেজ ক্রিয়াকলাপ ছাড়াও অন্তঃসত্ত্বা RNaseH কার্যকলাপ রয়েছে।RNaseH কার্যকলাপ এবং পলিমারেজ কার্যকলাপ RNA টেমপ্লেট এবং DNA প্রাইমার বা cDNA এক্সটেনশন স্ট্র্যান্ডের মধ্যে গঠিত হাইব্রিড স্ট্র্যান্ডের জন্য একে অপরের সাথে প্রতিযোগিতা করে এবং RNA:DNA কমপ্লেক্সে RNA স্ট্র্যান্ডকে অবনমিত করে।আরএনএ টেমপ্লেটটি আরএনএএসএইচ কার্যকলাপের দ্বারা অবনমিত হয়ে সিডিএনএ সংশ্লেষণের জন্য একটি কার্যকর সাবস্ট্রেট হিসাবে কাজ করতে পারে না, যা সিডিএনএ সংশ্লেষণের ফলন এবং দৈর্ঘ্য হ্রাস করে।অতএব, রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজের RNaseH কার্যকলাপকে বাদ দেওয়া বা ব্যাপকভাবে হ্রাস করা উপকারী হবে।

সুপারস্ক্রিপ্ট Ⅱ রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ, RNaseH- MMLV রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ এবং থার্মোস্ক্রিপ্ট রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ, RNaseH- AMV, MMLV এবং AMV এর চেয়ে বেশি পরিমাণ এবং পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের cDNA পেতে পারে।RT-PCR সংবেদনশীলতা সিডিএনএ সংশ্লেষণের পরিমাণ দ্বারা প্রভাবিত হবে।থার্মোস্ক্রিপ্ট AMV এর চেয়ে অনেক বেশি সংবেদনশীল।RT-PCR পণ্যের আকার বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজের সিডিএনএ সংশ্লেষণ করার ক্ষমতা দ্বারা সীমিত, বিশেষ করে যখন বড় সিডিএনএ ক্লোন করা হয়।MMLV-এর সাথে তুলনা করে, SuperScripⅡ দীর্ঘ RT-PCR পণ্যের ফলন উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি করেছে।RNaseH-রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজও থার্মোস্টেবিলিটি বাড়িয়েছে, তাই প্রতিক্রিয়াটি স্বাভাবিক 37-42 ডিগ্রি সেলসিয়াসের চেয়ে বেশি তাপমাত্রায় সঞ্চালিত হতে পারে।প্রস্তাবিত সংশ্লেষণ অবস্থার অধীনে, oligo(dT) প্রাইমার এবং [α-P]dCTP এর 10 μCi ব্যবহার করুন।প্রথম স্ট্র্যান্ডের মোট ফলন টিসিএ বৃষ্টিপাত পদ্ধতি ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল।পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের সিডিএনএ আকার-বাছাই করা ব্যান্ডগুলি ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং একটি ক্ষারীয় অ্যাগারোজ জেলে গণনা করা হয়েছিল।

3. বিপরীত প্রতিলিপির জন্য ইনকিউবেশন তাপমাত্রা বাড়ান：

উচ্চতর ইনকিউবেশন তাপমাত্রা RNA সেকেন্ডারি কাঠামো খুলতে সাহায্য করে, প্রতিক্রিয়ার ফলন বাড়ায়।বেশিরভাগ RNA টেমপ্লেটের জন্য, RNA এবং প্রাইমারগুলিকে বাফার বা লবণ ছাড়াই 65°C তাপমাত্রায় ইনকিউব করা, তারপরে বরফের উপর দ্রুত ঠাণ্ডা করা বেশিরভাগ গৌণ কাঠামোকে দূর করবে এবং প্রাইমারগুলিকে বাঁধতে দেবে।যাইহোক, কিছু টেমপ্লেটের এখনও গৌণ কাঠামো রয়েছে, এমনকি তাপ বিকৃতকরণের পরেও।এই কঠিন টেমপ্লেটগুলির পরিবর্ধন থার্মোস্ক্রিপ্ট রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্ট ব্যবহার করে সঞ্চালিত হতে পারে এবং প্রশস্তকরণের উন্নতির জন্য একটি উচ্চ তাপমাত্রায় বিপরীত প্রতিলিপি প্রতিক্রিয়া স্থাপন করা যেতে পারে।উচ্চতর ইনকিউবেশন তাপমাত্রাও নির্দিষ্টতা বাড়াতে পারে, বিশেষ করে যখন সিডিএনএ সংশ্লেষণের জন্য জিন-নির্দিষ্ট প্রাইমার (জিএসপি) ব্যবহার করা হয় (অধ্যায় 3 দেখুন)।GSP ব্যবহার করলে, নিশ্চিত করুন যে প্রাইমারগুলির Tm প্রত্যাশিত ইনকিউবেশন তাপমাত্রার সমান।60°C এর উপরে oligo(dT) এবং এলোমেলো প্রাইমার ব্যবহার করবেন না।র্যান্ডম প্রাইমারের জন্য 60 ডিগ্রি সেলসিয়াসে বাড়ানোর আগে 10 মিনিটের জন্য 25 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ইনকিউবেশন প্রয়োজন।উচ্চতর রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন তাপমাত্রা ব্যবহার করার পাশাপাশি, RNA/প্রাইমার মিশ্রণকে 65°C denaturation তাপমাত্রা থেকে বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন ইনকিউবেশন তাপমাত্রায় সরাসরি স্থানান্তর করে এবং একটি পূর্ব-উষ্ণ 2× প্রতিক্রিয়া মিশ্রণ (cDNA হট-স্টার্ট সংশ্লেষণ) যোগ করে নির্দিষ্টতা উন্নত করা যেতে পারে।এই পদ্ধতিটি নিম্ন তাপমাত্রায় ঘটে এমন আন্তঃআণবিক বেস পেয়ারিং প্রতিরোধ করতে সাহায্য করে।RT-PCR-এর জন্য প্রয়োজনীয় একাধিক তাপমাত্রা পরিবর্তন একটি থার্মাল সাইক্লার ব্যবহার করে সরল করা যেতে পারে।

Tth থার্মোস্টেবল পলিমারেজ Mg2+ এর উপস্থিতিতে DNA পলিমারেজ এবং Mn2+ এর উপস্থিতিতে RNA পলিমারেজ হিসেবে কাজ করে।এটি সর্বোচ্চ 65 ডিগ্রি সেলসিয়াসে উষ্ণ রাখা যেতে পারে।যাইহোক, PCR-এর সময় Mn2+ এর উপস্থিতি বিশ্বস্ততা হ্রাস করে, যা Tth পলিমারেজকে উচ্চ-নির্ভুল পরিবর্ধনের জন্য কম উপযুক্ত করে তোলে, যেমন cDNA-এর ক্লোনিং।উপরন্তু, Tth-এর কম বিপরীত প্রতিলিপি কার্যকারিতা রয়েছে, যা সংবেদনশীলতা হ্রাস করে, এবং যেহেতু বিপরীত প্রতিলিপি এবং PCR একটি একক এনজাইম দিয়ে সঞ্চালিত হতে পারে, তাই বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন ছাড়া নিয়ন্ত্রণ প্রতিক্রিয়াগুলিকে জিনোমিক ডিএনএ দূষিত করার সাথে cDNA পরিবর্ধন পণ্যগুলির তুলনা করতে ব্যবহার করা যায় না।পরিবর্ধন পণ্য পৃথক করা হয়.

4. সংযোজন যা বিপরীত প্রতিলিপি প্রচার করে:

গ্লিসারল এবং DMSO সহ সংযোজনগুলি প্রথম-স্ট্র্যান্ড সংশ্লেষণ বিক্রিয়ায় যোগ করা হয়, যা নিউক্লিক অ্যাসিড ডাবল-স্ট্র্যান্ডের স্থায়িত্ব হ্রাস করতে পারে এবং আরএনএর গৌণ কাঠামোকে মুক্ত করতে পারে।সুপারস্ক্রিপ্ট II বা MMLV কার্যকলাপকে প্রভাবিত না করে 20% পর্যন্ত গ্লিসারল বা 10% DMSO যোগ করা যেতে পারে।AMV 20% পর্যন্ত গ্লিসারল সহ্য করতে পারে কার্যকলাপের ক্ষতি ছাড়াই।সুপারস্ক্রিপ্টⅡ রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন প্রতিক্রিয়াতে RT-PCR-এর সংবেদনশীলতা সর্বাধিক করার জন্য, 10% গ্লিসারল যোগ করা যেতে পারে এবং 45 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ইনকিউব করা যেতে পারে।যদি বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন প্রতিক্রিয়া পণ্যের 1/10 পিসিআর-এ যোগ করা হয়, তাহলে পরিবর্ধন প্রতিক্রিয়াতে গ্লিসারলের ঘনত্ব 0.4%, যা পিসিআরকে বাধা দেওয়ার জন্য যথেষ্ট নয়।

5. RNaseH চিকিত্সা:

পিসিআর-এর আগে RNaseH-এর সাথে সিডিএনএ সংশ্লেষণ প্রতিক্রিয়াগুলির চিকিত্সা সংবেদনশীলতা বাড়াতে পারে।কিছু টেমপ্লেটের জন্য, এটা মনে করা হয় যে সিডিএনএ সংশ্লেষণ প্রতিক্রিয়ায় আরএনএ পরিবর্ধন পণ্যের বাঁধনকে বাধা দেয়, এই ক্ষেত্রে RNaseH চিকিত্সা সংবেদনশীলতা বাড়াতে পারে।সাধারণত, কম-কপি টিউবারাস স্কেরোসিস II-এর মতো দীর্ঘ পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের সিডিএনএ টার্গেট টেমপ্লেটগুলিকে প্রশস্ত করার সময় RNaseH চিকিত্সা প্রয়োজন।এই কঠিন টেমপ্লেটের জন্য, RNaseH চিকিত্সা সুপারস্ক্রিপ্ট II বা AMV-সংশ্লেষিত cDNA দ্বারা উত্পাদিত সংকেতকে উন্নত করেছে।বেশিরভাগ RT-PCR প্রতিক্রিয়ার জন্য, RNaseH চিকিত্সা ঐচ্ছিক, কারণ 95°C তাপমাত্রায় PCR ডিনাচুরেশন ধাপ সাধারণত RNA:DNA কমপ্লেক্সে RNA কে হাইড্রোলাইজ করে।

6. ছোট RNA সনাক্তকরণ পদ্ধতির উন্নতি:

RT-PCR বিশেষত চ্যালেঞ্জিং যখন শুধুমাত্র অল্প পরিমাণে আরএনএ পাওয়া যায়।আরএনএ বিচ্ছিন্নতার সময় বাহক হিসেবে যোগ করা গ্লাইকোজেন ছোট নমুনার ফলন বাড়াতে সাহায্য করে।Trizol যোগ করার সাথে সাথে RNase-মুক্ত গ্লাইকোজেন যোগ করা যেতে পারে।গ্লাইকোজেন পানিতে দ্রবণীয় এবং পরবর্তী বর্ষণে সাহায্য করার জন্য RNA এর সাথে জলীয় পর্যায়ে রাখা যেতে পারে।50 মিলিগ্রামের কম টিস্যু বা 106 কালচারড কোষের নমুনার জন্য, RNase-মুক্ত গ্লাইকোজেনের প্রস্তাবিত ঘনত্ব হল 250 μg/ml।

সুপারস্ক্রিপ্ট II ব্যবহার করে বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন প্রতিক্রিয়াতে অ্যাসিটাইলেটেড বিএসএ যুক্ত করা সংবেদনশীলতা বাড়াতে পারে এবং অল্প পরিমাণে RNA-এর জন্য, সুপারস্ক্রিপ্ট II-এর পরিমাণ হ্রাস করে এবং RNaseOut নিউক্লিজ ইনহিবিটর-এর 40 ইউনিট যোগ করা সনাক্তকরণের মাত্রা বাড়াতে পারে।যদি আরএনএ বিচ্ছিন্নকরণ প্রক্রিয়ায় গ্লাইকোজেন ব্যবহার করা হয়, তবে বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন প্রতিক্রিয়ার জন্য সুপারস্ক্রিপ্ট II ব্যবহার করার সময় BSA বা RNase ইনহিবিটর যোগ করার পরামর্শ দেওয়া হয়।

二、আরটি-পিসিআর নির্দিষ্টতা বৃদ্ধি করুন

1. সিএনডি অ্যাসিন্থেসিস:

প্রথম-স্ট্র্যান্ড সিডিএনএ সংশ্লেষণ তিনটি ভিন্ন পদ্ধতি ব্যবহার করে শুরু করা যেতে পারে, যার আপেক্ষিক নির্দিষ্টতা সিডিএনএ সংশ্লেষিত পরিমাণ এবং প্রকারকে প্রভাবিত করে।

র্যান্ডম প্রাইমার পদ্ধতিটি তিনটি পদ্ধতির মধ্যে সর্বনিম্ন নির্দিষ্ট ছিল।প্রাইমারগুলি ট্রান্সক্রিপ্ট জুড়ে একাধিক সাইটে অ্যানিল করে, ছোট, আংশিক-দৈর্ঘ্যের সিডিএনএ তৈরি করে।এই পদ্ধতিটি প্রায়শই 5′ শেষ ক্রম প্রাপ্ত করতে এবং গৌণ কাঠামোর অঞ্চলগুলির সাথে বা সমাপ্তির সাইটগুলির সাথে RNA টেমপ্লেটগুলি থেকে cDNA প্রাপ্ত করতে ব্যবহৃত হয় যা বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজ দ্বারা প্রতিলিপি করা যায় না।দীর্ঘতম সিডিএনএ পাওয়ার জন্য, প্রতিটি আরএনএ নমুনায় প্রাইমারের আরএনএর অনুপাত পরীক্ষামূলকভাবে নির্ধারণ করা প্রয়োজন।এলোমেলো প্রাইমারগুলির প্রারম্ভিক ঘনত্ব প্রতি 20 μl প্রতিক্রিয়ায় 50 থেকে 250 এনজি পর্যন্ত ছিল।যেহেতু এলোমেলো প্রাইমার ব্যবহার করে মোট RNA থেকে সংশ্লেষিত cDNA প্রাথমিকভাবে রাইবোসোমাল RNA, তাই পলি(A)+RNA সাধারণত টেমপ্লেট হিসেবে বেছে নেওয়া হয়।

অলিগো (ডিটি) প্রাইমারগুলি এলোমেলো প্রাইমারগুলির চেয়ে আরও নির্দিষ্ট।এটি বেশিরভাগ ইউক্যারিওটিক mRNA-এর 3′ প্রান্তে পাওয়া পলি(A) লেজে সংকর করে।যেহেতু পলি(এ)+ আরএনএ মোট আরএনএর প্রায় 1% থেকে 2%, সিডিএনএর পরিমাণ এবং জটিলতা র্যান্ডম প্রাইমারের তুলনায় অনেক কম।এর উচ্চ নির্দিষ্টতার কারণে, অলিগো(ডিটি) সাধারণত প্রাইমার এবং পলি(এ)+ নির্বাচনের সাথে আরএনএর অনুপাতের অপ্টিমাইজেশনের প্রয়োজন হয় না।প্রতি 20μl প্রতিক্রিয়া সিস্টেমে 0.5μg oligo(dT) ব্যবহার করার পরামর্শ দেওয়া হয়।oligo(dT)12-18 বেশিরভাগ RT-PCR এর জন্য উপযুক্ত।ThermoScript RT-PCR সিস্টেম অলিগো(dT)20 অফার করে কারণ উচ্চতর ইনকিউবেশন তাপমাত্রার জন্য এটির ভাল তাপীয় স্থিতিশীলতা রয়েছে।

জিন স্পেসিফিক প্রাইমার (GSP) হল রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন স্টেপের জন্য সবচেয়ে নির্দিষ্ট প্রাইমার।জিএসপি হল একটি অ্যান্টিসেন্স অলিগোনিউক্লিওটাইড যা বিশেষভাবে আরএনএ টার্গেট সিকোয়েন্সে হাইব্রিডাইজ করতে পারে, এলোমেলো প্রাইমার বা অলিগো(ডিটি) থেকে ভিন্ন, যা সমস্ত আরএনএ-কে অ্যানিল করে।পিসিআর প্রাইমার ডিজাইন করতে ব্যবহৃত একই নিয়মগুলি বিপরীত প্রতিলিপি বিক্রিয়ায় জিএসপি-র ডিজাইনের ক্ষেত্রে প্রযোজ্য।জিএসপি এমপ্লিফিকেশন প্রাইমারের মতো একই ক্রম হতে পারে যা এমআরএনএর 3′-সবচেয়ে শেষ প্রান্তে অ্যানিল করে, অথবা জিএসপিকে রিভার্স অ্যামপ্লিফিকেশন প্রাইমারের নিচের দিকে অ্যানিল করার জন্য ডিজাইন করা যেতে পারে।কিছু পরিবর্ধিত বিষয়ের জন্য, সফল RT-PCR-এর জন্য একাধিক অ্যান্টিসেন্স প্রাইমার ডিজাইন করা প্রয়োজন কারণ লক্ষ্য RNA-এর গৌণ কাঠামো প্রাইমার বাঁধাই প্রতিরোধ করতে পারে।এটি একটি 20 μl প্রথম-স্ট্র্যান্ড সংশ্লেষণ প্রতিক্রিয়ায় 1 pmol antisense GSP ব্যবহার করার পরামর্শ দেওয়া হয়।

2. বিপরীত প্রতিলিপির জন্য ইনকিউবেশন তাপমাত্রা বাড়ান：

জিএসপি নির্দিষ্টতার পূর্ণ সুবিধার সম্পূর্ণ সুবিধা নিতে, উচ্চ থার্মোস্টেবিলিটি সহ একটি বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্ট ব্যবহার করা উচিত।থার্মোস্টেবল রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেসগুলি প্রতিক্রিয়া কঠোরতা বাড়ানোর জন্য উচ্চ তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করা যেতে পারে।উদাহরণস্বরূপ, যদি একটি জিএসপি 55 ডিগ্রি সেলসিয়াসে এনিয়েলস করে, তবে 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসের কম কঠোরতায় বিপরীত প্রতিলিপির জন্য AMV বা M-MLV ব্যবহার করা হলে GSP-এর নির্দিষ্টতা সম্পূর্ণরূপে ব্যবহার করা হবে না।যাইহোক, SuperScript II এবং ThermoScript 50°C বা তার বেশি তাপমাত্রায় প্রতিক্রিয়াশীল হতে পারে, যা নিম্ন তাপমাত্রায় উৎপন্ন অ-নির্দিষ্ট পণ্যগুলিকে সরিয়ে দেবে।সর্বাধিক নির্দিষ্টতার জন্য, আরএনএ/প্রাইমার মিশ্রণটি সরাসরি 65°C বিকৃত তাপমাত্রা থেকে বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন ইনকিউবেশন তাপমাত্রায় স্থানান্তরিত করা যেতে পারে এবং একটি পূর্ব-উষ্ণ 2× প্রতিক্রিয়া মিশ্রণে (cDNA সংশ্লেষণ হট স্টার্ট) যোগ করা যেতে পারে।এটি কম তাপমাত্রায় আন্তঃআণবিক বেস জোড়া প্রতিরোধ করতে সাহায্য করে।RT-PCR-এর জন্য প্রয়োজনীয় একাধিক তাপমাত্রা পরিবর্তন একটি তাপ সাইক্লার ব্যবহার করে সরল করা যেতে পারে।

3. জিনোমিক ডিএনএ দূষণ হ্রাস করে:

RT-PCR-এর একটি সম্ভাব্য অসুবিধা হল RNA-তে জিনোমিক DNA-এর দূষণ।একটি ভাল আরএনএ বিচ্ছিন্নকরণ পদ্ধতি ব্যবহার করে, যেমন ট্রিজল বিকারক, আরএনএ প্রস্তুতিকে দূষিত করে জিনোমিক ডিএনএর পরিমাণ কমিয়ে দেবে।জিনোমিক ডিএনএ থেকে প্রাপ্ত পণ্য এড়াতে, বিপরীত প্রতিলিপির আগে দূষিত ডিএনএ অপসারণের জন্য আরএনএ-কে পরিবর্ধন-গ্রেড DNase I দিয়ে চিকিত্সা করা যেতে পারে।65 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 10 মিনিটের জন্য 2.0 মিমি ইডিটিএতে নমুনাগুলি ইনকিউব করে DNase I হজম বন্ধ করা হয়েছিল।ইডিটিএ উচ্চ তাপমাত্রায় ম্যাগনেসিয়াম আয়ন-নির্ভর আরএনএ হাইড্রোলাইসিস প্রতিরোধ করে ম্যাগনেসিয়াম আয়নগুলিকে চিলেট করতে পারে।

জিনোমিক ডিএনএ পরিবর্ধন পণ্যগুলিকে দূষিত করা থেকে পরিবর্ধিত সিডিএনএকে পৃথক করার জন্য, প্রাইমারগুলি এমন ডিজাইন করা যেতে পারে যে প্রতিটি অ্যানিল এক্সনগুলিকে পৃথক করে।সিডিএনএ থেকে প্রাপ্ত পিসিআর পণ্যগুলি দূষিত জিনোমিক ডিএনএ থেকে প্রাপ্ত পণ্যগুলির চেয়ে ছোট হবে।এছাড়াও, একটি প্রদত্ত খণ্ড জিনোমিক ডিএনএ বা সিডিএনএ থেকে প্রাপ্ত হয়েছে কিনা তা নির্ধারণ করতে প্রতিটি আরএনএ টেমপ্লেটে বিপরীত প্রতিলিপি ছাড়াই একটি নিয়ন্ত্রণ পরীক্ষা করা হয়েছিল।বিপরীত প্রতিলিপি ছাড়াই প্রাপ্ত পিসিআর পণ্যটি জিনোম থেকে প্রাপ্ত।