সবাই qRT-PCR পরীক্ষার নীতি, প্রাইমার ডিজাইন, ফলাফলের ব্যাখ্যা ইত্যাদি নিয়ে কথা বলছে, কিন্তু আমি মনে করি আপনার সাথে qRT-PCR-এর পরীক্ষামূলক অপারেশন শেয়ার করা উচিত।এটা ছোট, কিন্তু এটা ফলাফল সম্পর্কে.
কিউআরটি-পিসিআর করার আগে, আমাদের নিজস্ব আরএনএ এবং অপারেশন পদ্ধতিগুলি সম্পর্কে স্পষ্ট ধারণা থাকা দরকার।সর্বোপরি, আমাদের প্রচেষ্টা কেবল অনুশীলনের পরিবর্তে ফলাফল অর্জনের লক্ষ্যে।তাই qRT-PCR করার আগে, আমাদের নিম্নলিখিত বিষয়গুলি নির্ধারণ করতে হবে (যার মধ্যে কিছু শুধুমাত্র SYBR এর ক্ষেত্রে প্রযোজ্য)।
1 আপনি কি নিশ্চিত যে আপনার আরএনএ অবনতি হয়নি?
NanoDrop 2000 শুধুমাত্র RNA এর ঘনত্ব এবং বিশুদ্ধতা সনাক্ত করতে পারে, কিন্তু RNA এর অখণ্ডতা সনাক্ত করতে পারে না।
RNA (RNA Intesity Number) মান RNA এর অখণ্ডতা প্রতিফলিত করতে পারে, যা Agilent 2100 Bioanalyzer সিস্টেম দ্বারা সনাক্ত করা হয়।
চিত্র। বিভিন্ন RNA নমুনার (ইউক্যারিওটস) জন্য RIN মানের পরিকল্পিত চিত্র
যাইহোক, ল্যাবরেটরিতে সাধারণত Agilent 2100 Bioanalyzer নেই।এই ক্ষেত্রে, আমরা ফর্মালডিহাইড জেলের মাধ্যমে সনাক্ত করতে পারি, তবে মোট RNA এর প্রয়োজনীয়তা বেশি, তাই দ্রুততম পদ্ধতি হল সাধারণ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস ব্যবহার করা।এটি একটি নিউক্লিজ-মুক্ত পরিবেশে থাকা প্রয়োজন, তাই ইলেক্ট্রোফোরেসিস ট্যাঙ্ক, সোল বোতল, জেল বন্ধনী এবং DEPC জল দিয়ে চিরুনি ধুয়ে ফেলতে হবে।অ্যাগারোজও নিউক্লিজ-মুক্ত (যতক্ষণ এটি নতুনভাবে খোলা হয়), এবং লোডিং বাফারটি 1.2% জেল সহ যতটা সম্ভব তাজাভাবে খোলা উচিত।
নোট করুন যে জেলটি সম্পূর্ণরূপে দ্রবীভূত করা উচিত, অন্যথায় এটি অসঙ্গতিপূর্ণ ব্যান্ড সৃষ্টি করবে, যেমন চিত্রের নমুনা 9 এ দেখানো হয়েছে।ভোল্টেজ খুব বেশি হলে বা খুব বেশি সময় ধরে চললে তাপ উৎপন্ন হবে এবং আরএনএ ক্ষয় হবে, তাই ভোল্টেজ এবং সময় যুক্তিসঙ্গতভাবে নিয়ন্ত্রণ করা উচিত।উপরন্তু, জেল চলমান আরও নির্ধারণ করতে পারে যে নমুনায় ডিএনএ অবশিষ্টাংশ আছে কিনা এবং বিতরণ কূপে প্রচুর পরিমাণে ধরে রাখা ব্যান্ড রয়েছে কিনা তা পর্যবেক্ষণ করতে পারে।
চিত্র।জেল ইলেক্ট্রোফোরসিস আরএনএ সনাক্তকরণ
2 আপনি কি আপনার cDNA এর ঘনত্ব সম্পর্কে নিশ্চিত?
ল্যাবরেটরিতে বড় ভাইদের অভিজ্ঞতা হল যে প্রতিটি ইনভার্সন দ্বারা প্রাপ্ত 20 উল সিস্টেমের সিডিএনএ সরাসরি 20X পাতলা হয়, যখন পোস্ট-ডক্টরাল বোনদের 10X পাতলা করা হয়।আমি সাধারণত পরিস্থিতির উপর নির্ভর করি।কারণ প্রতিটি ব্যক্তির দ্বারা উল্লিখিত আরএনএর গুণমান ভিন্ন, বিপরীত স্তরও ভিন্ন, এবং বিপরীত প্রযুক্তি স্থিতিশীল নাও হতে পারে।
তাই যতবার আমি বিপরীত সিডিএনএ পাব, আমি প্রথমে এটি প্রায় 3 বার পাতলা করব, এবং তারপরে RT-PCR করার জন্য হাউসকিপিং জিন ব্যবহার করব, নির্দিষ্ট ঘনত্ব সনাক্ত করতে চক্রের সংখ্যা সাধারণত 25 চক্র হয়, এবং তারপরে চূড়ান্ত তরল ফ্যাক্টর নির্ধারণ করতে।
3 আপনি কি নিশ্চিত যে আপনার প্রাইমারগুলি ব্যবহার করা সহজ?
এটি qRT-PCR এর গলে যাওয়া বক্ররেখা অতিক্রম করতে পারে, তবে এর জন্য এখনও অর্থ খরচ হয়।অনেক টাকা ছাড়া ল্যাবরেটরিগুলির জন্য, যখন তারা প্রচুর প্রাইমার পায়, তখন তারা সাধারণ RT-PCR ব্যবহার করে দেখতে পারে যে এটি একটি একক ব্যান্ড কিনা এবং প্রাইমারগুলির নির্দিষ্টতা সনাক্ত করতে পারে।ল্যাবরেটরিতে অর্থের অভাব না হলে, গলিত বক্ররেখার মাধ্যমে একবার সমস্ত প্রাইমারের নির্দিষ্টতা সনাক্ত করা যেতে পারে।
4 আপনি কি নিশ্চিত যে আপনার পরীক্ষামূলক অবস্থা উপযুক্ত?
SYBR কে শক্তিশালী আলো থেকে সুরক্ষিত করা উচিত, তাই SYBR রিএজেন্ট যোগ করার সময় ওভারহেড লাইট বন্ধ করার চেষ্টা করুন এবং এটি সম্পূর্ণ করতে শুধুমাত্র আবছা আলো ব্যবহার করতে হবে।
SYBR 4°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করুন।ব্যবহার করার সময়, ফোমিং এড়াতে ভালভাবে মেশানোর জন্য আলতোভাবে উপরে এবং নীচে উল্টে দিন এবং জোরে ঘূর্ণি করবেন না।
কিছু ছোট বোন নমুনাগুলি মিশ্রিত হওয়ার ভয়ে পিসিআর বোর্ডে চিহ্ন আঁকতে পছন্দ করে, যা ভুল।যেহেতু আপনার মার্কারগুলি ফ্লুরোসেন্ট সংকেতগুলির সংগ্রহকে প্রভাবিত করতে পারে, তাই আমি সাধারণত জুনিয়রদের মেমরিতে সহায়তা করার জন্য পরীক্ষামূলক নোটবুক ব্যবহার করার পরামর্শ দিই, যেমনটি নীচে দেখানো হয়েছে।
চিত্র।qRT-PCR নমুনা লোডিং ডায়াগ্রাম
5 আপনি কি নিশ্চিত আপনি এটা ঠিক করছেন?
গ্লাভস পরতে ভুলবেন না, গ্লাভস পরুন, গ্লাভস পরুন এবং গুরুত্বপূর্ণ জিনিসগুলি তিনবার বলুন।
আলোতে SYBR-এর এক্সপোজার কমাতে, আমি ব্যক্তিগতভাবে প্রথমে একটি টেমপ্লেট যোগ করতে চাই, যেমনটি নীচের চিত্রে দেখানো হয়েছে।অভিজ্ঞতা অনুসারে, অল্প পরিমাণে টেমপ্লেট যোগ করলে নমুনা সংক্রান্ত ত্রুটি হতে পারে।তাই, অল্প পরিমাণে টেমপ্লেট যোগ করার ফলে সৃষ্ট ত্রুটি কমানোর জন্য, আমি সাধারণত আবার নমুনা দ্বিগুণ করি এবং H2O2 যোগ করার পরিমাণ কমাতে নমুনা যোগ করার সময় দ্বিগুণ করি।
চিত্র।কিউআরটি-পিসিআর লোডিংয়ের পরিকল্পিত চিত্র
তারপর নিম্নরূপ qRT-PCR সিস্টেম কনফিগার করুন।
চিত্র।qRT-PCR সিস্টেম প্রস্তুতির চিত্র
দ্রষ্টব্য: কনফিগারেশন প্রক্রিয়াটি বরফের উপর করা দরকার।
নমুনা যোগ করার পরে, স্বচ্ছ সিলিং ফিল্ম পেস্ট করুন।আপনার হাত দিয়ে স্বচ্ছ সিলিং ফিল্মের পৃষ্ঠকে স্পর্শ না করার চেষ্টা করুন, ফিল্মের উভয় পাশের স্থান থেকে কাজ করুন।কারণ আঙুলের ছাপ ফ্লুরোসেন্ট সংকেত সংগ্রহকেও প্রভাবিত করতে পারে।তারপরে একটি সেন্ট্রিফিউজ ব্যবহার করুন দ্রুত 10 সেকেন্ডের জন্য কম গতিতে সেন্ট্রিফিউজ করতে যাতে নমুনাটি দেয়ালে ঝুলতে না পারে।
সংশ্লিষ্ট পণ্য:
পোস্টের সময়: এপ্রিল-২৮-২০২৩
