পিসিআর (পলিমারেজ চেইন রিঅ্যাকশন) হল ইন-ভিট্রো ডিএনএ অ্যামপ্লিফিকেশন প্রযুক্তিগুলির মধ্যে একটি, যার ইতিহাস 30 বছরেরও বেশি।

পিসিআর প্রযুক্তি 1983 সালে মার্কিন যুক্তরাষ্ট্রের সেটাসের ক্যারি মুলিস দ্বারা অগ্রণী হয়েছিল। মুলিস 1985 সালে একটি পিসিআর পেটেন্টের জন্য আবেদন করেছিলেন এবং একই বছরে বিজ্ঞানের উপর প্রথম পিসিআর একাডেমিক পেপার প্রকাশ করেছিলেন।মুলিস তার কাজের জন্য 1993 সালে রসায়নে নোবেল পুরস্কার লাভ করেন।

PCR এর মৌলিক নীতি

পিসিআর টার্গেট ডিএনএ খণ্ডকে এক মিলিয়নেরও বেশি বার বাড়িয়ে দিতে পারে।নীতিটি ডিএনএ পলিমারেজের অনুঘটকের অধীনে, একটি টেমপ্লেট হিসাবে প্যারেন্ট স্ট্র্যান্ড ডিএনএ এবং এক্সটেনশনের সূচনা বিন্দু হিসাবে নির্দিষ্ট প্রাইমার ব্যবহার করে।এটি বিকৃতকরণ, অ্যানিলিং এবং এক্সটেনশনের মতো পদক্ষেপের মাধ্যমে ভিট্রোতে প্রতিলিপি করা হয়।কন্যা স্ট্র্যান্ড ডিএনএ প্রক্রিয়াটি প্যারেন্ট স্ট্র্যান্ড টেমপ্লেট ডিএনএর পরিপূরক।

স্ট্যান্ডার্ড পিসিআর প্রক্রিয়া তিনটি ধাপে বিভক্ত:

1. ডিনাচুরেশন: ডিএনএ ডাবল স্ট্র্যান্ড আলাদা করতে উচ্চ তাপমাত্রা ব্যবহার করুন।ডিএনএ ডাবল স্ট্র্যান্ডের মধ্যে হাইড্রোজেন বন্ধন উচ্চ তাপমাত্রায় (93-98℃) ভেঙে যায়।

2. অ্যানিলিং: ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ আলাদা হওয়ার পরে, তাপমাত্রা কম করুন যাতে প্রাইমারটি একক-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ-র সাথে আবদ্ধ হতে পারে।

3. এক্সটেনশন: তাপমাত্রা কম হলে ডিএনএ পলিমারেজ আবদ্ধ প্রাইমার থেকে ডিএনএ স্ট্র্যান্ডের সাথে পরিপূরক স্ট্র্যান্ডগুলিকে সংশ্লেষিত করতে শুরু করে।যখন এক্সটেনশন সম্পন্ন হয়, একটি চক্র সম্পূর্ণ হয়, এবং ডিএনএ খণ্ডের সংখ্যা দ্বিগুণ হয়

এই তিনটি ধাপকে 25-35 বার প্রতিদান করলে, DNA খণ্ডের সংখ্যা দ্রুতগতিতে বৃদ্ধি পাবে।

পিসিআর এর চাতুর্য হল যে বিভিন্ন প্রাইমার বিভিন্ন টার্গেট জিনের জন্য ডিজাইন করা যেতে পারে, যাতে টার্গেট জিনের টুকরোগুলি অল্প সময়ের মধ্যে প্রসারিত করা যায়।

এখন পর্যন্ত, পিসিআরকে তিনটি বিভাগে ভাগ করা যায়, যথা সাধারণ পিসিআর, ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর এবং ডিজিটাল পিসিআর।

সাধারণ পিসিআরের প্রথম প্রজন্ম

লক্ষ্য জিনকে প্রশস্ত করতে একটি সাধারণ পিসিআর পরিবর্ধন যন্ত্র ব্যবহার করুন এবং তারপর পণ্যটি সনাক্ত করতে অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস ব্যবহার করুন, শুধুমাত্র গুণগত বিশ্লেষণ করা যেতে পারে।

প্রথম প্রজন্মের পিসিআর এর প্রধান অসুবিধা:

1. অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন এবং মিথ্যা ইতিবাচক ফলাফল প্রবণ.

2. সনাক্তকরণ একটি দীর্ঘ সময় লাগে এবং অপারেশন কষ্টকর.

3. শুধুমাত্র গুণগত পরীক্ষা করা যেতে পারে

দ্বিতীয় প্রজন্মের রিয়েল-টাইম পিসিআর

রিয়েল-টাইম পিসিআর, কিউপিসিআর নামেও পরিচিত, ফ্লুরোসেন্ট প্রোব ব্যবহার করে যা প্রতিক্রিয়া সিস্টেমের অগ্রগতি নির্দেশ করতে পারে, এবং ফ্লুরোসেন্ট সংকেত জমার মাধ্যমে পরিবর্ধিত পণ্যের জমা হওয়া নিরীক্ষণ করে এবং ফ্লুরোসেন্ট বক্ররেখার মাধ্যমে ফলাফল বিচার করে।এটি Cq মান এবং আদর্শ বক্ররেখার সাহায্যে পরিমাপ করা যেতে পারে।

যেহেতু qPCR প্রযুক্তি একটি বদ্ধ ব্যবস্থায় পরিচালিত হয়, দূষণের সম্ভাবনা হ্রাস পায়, এবং ফ্লুরোসেন্স সংকেত পরিমাণগত সনাক্তকরণের জন্য নিরীক্ষণ করা যেতে পারে, তাই এটি ক্লিনিকাল অনুশীলনে সর্বাধিক ব্যবহৃত হয় এবং এটি PCR-তে প্রভাবশালী প্রযুক্তিতে পরিণত হয়েছে।

রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর-এ ব্যবহৃত ফ্লুরোসেন্ট পদার্থগুলিকে ভাগ করা যেতে পারে: TaqMan ফ্লুরোসেন্ট প্রোব, আণবিক বীকন এবং ফ্লুরোসেন্ট ডাই।

1) TaqMan ফ্লুরোসেন্ট প্রোব:

পিসিআর পরিবর্ধনের সময়, প্রাইমারের জোড়া যুক্ত করার সময় একটি নির্দিষ্ট ফ্লুরোসেন্ট প্রোব যোগ করা হয়।প্রোব একটি অলিগোনিউক্লিওটাইড, এবং উভয় প্রান্ত একটি রিপোর্টার ফ্লুরোসেন্ট গ্রুপ এবং একটি quencher ফ্লুরোসেন্ট গ্রুপ দিয়ে লেবেল করা হয়।

যখন প্রোব অক্ষত থাকে, রিপোর্টার গ্রুপ দ্বারা নির্গত ফ্লুরোসেন্ট সংকেত quenching গ্রুপ দ্বারা শোষিত হয়;PCR পরিবর্ধনের সময়, Taq এনজাইমের 5′-3′ exonuclease কার্যকলাপ প্রোবকে ক্লিভ করে এবং ক্ষয় করে, যার ফলে রিপোর্টার ফ্লুরোসেন্ট গ্রুপ এবং ফ্লুরোসেন্ট গ্রুপকে আলাদা করা হয়, যাতে ফ্লুরোসেন্স মনিটরিং সিস্টেম ফ্লুরোসেন্স সিগন্যাল গ্রহণ করতে পারে, অর্থাৎ, প্রতিবার একটি ফ্লুরোসেন্ট ফর্ম এবং এমএনএ ফ্লুরোসেন্ট ফ্লুরোসেন্ট আকারে তৈরি হয়। ফ্লুরোসেন্স সিগন্যাল জমে সম্পূর্ণভাবে পিসিআর পণ্য গঠনের সাথে সিঙ্ক্রোনাইজ করা হয়।

2) SYBR ফ্লুরোসেন্ট ডাই:

পিসিআর প্রতিক্রিয়া পদ্ধতিতে, অতিরিক্ত SYBR ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জক যোগ করা হয়।SYBR ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জক ডিএনএ ডাবল-স্ট্র্যান্ডে অ-নির্দিষ্টভাবে অন্তর্ভুক্ত করার পরে, এটি একটি ফ্লুরোসেন্ট সংকেত নির্গত করে।SYBR ডাই অণু যেটি চেইনের মধ্যে অন্তর্ভুক্ত নয় তা কোনো ফ্লুরোসেন্ট সংকেত নির্গত করবে না, যার ফলে ফ্লুরোসেন্ট সিগন্যাল নিশ্চিত করা হবে।এসওয়াইবিআর শুধুমাত্র ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএর সাথে আবদ্ধ হয়, তাই পিসিআর প্রতিক্রিয়া নির্দিষ্ট কিনা তা নির্ধারণ করতে গলন বক্ররেখা ব্যবহার করা যেতে পারে।

3) আণবিক বীকন:

এটি একটি স্টেম-লুপ ডবল-লেবেলযুক্ত অলিগোনিউক্লিওটাইড প্রোব যা 5 এবং 3 প্রান্তে প্রায় 8টি বেসের একটি হেয়ারপিন গঠন তৈরি করে।উভয় প্রান্তে নিউক্লিক অ্যাসিড ক্রমগুলি পরিপূরকভাবে জোড়া হয়, যার ফলে ফ্লুরোসেন্ট গ্রুপ এবং quenching গ্রুপ টাইট হয়।বন্ধ করুন, কোন ফ্লুরোসেন্স উত্পাদিত হবে না।

পিসিআর পণ্য তৈরি হওয়ার পরে, অ্যানিলিং প্রক্রিয়া চলাকালীন, আণবিক বীকনের মাঝখানের অংশটি একটি নির্দিষ্ট ডিএনএ অনুক্রমের সাথে যুক্ত হয় এবং ফ্লুরোসেন্ট জিনটি ফ্লুরোসেন্স তৈরি করতে quencher জিন থেকে আলাদা করা হয়।

দ্বিতীয় প্রজন্মের পিসিআর এর প্রধান অসুবিধা:

সংবেদনশীলতার এখনও অভাব রয়েছে, এবং কম-কপি নমুনাগুলির সনাক্তকরণ ভুল।

ব্যাকগ্রাউন্ড মানের প্রভাব আছে, এবং ফলাফল হস্তক্ষেপের জন্য সংবেদনশীল।

যখন প্রতিক্রিয়া সিস্টেমে পিসিআর ইনহিবিটার থাকে, তখন সনাক্তকরণের ফলাফল হস্তক্ষেপের জন্য সংবেদনশীল।

তৃতীয় প্রজন্মের ডিজিটাল পিসিআর

ডিজিটাল পিসিআর (ডিজিটালপিসিআর, ডিপিসিআর, ডিজি-পিসিআর) শেষ-বিন্দু সনাক্তকরণের মাধ্যমে লক্ষ্য ক্রমটির অনুলিপি সংখ্যা গণনা করে এবং অভ্যন্তরীণ নিয়ন্ত্রণ এবং মানক বক্ররেখা ব্যবহার না করেই সঠিক পরম পরিমাণগত সনাক্তকরণ করতে পারে।

ডিজিটাল পিসিআর এন্ড-পয়েন্ট সনাক্তকরণ ব্যবহার করে এবং এটি Ct মানের (সাইকেল থ্রেশহোল্ড) উপর নির্ভর করে না, তাই ডিজিটাল পিসিআর প্রতিক্রিয়া পরিবর্ধন দক্ষতার দ্বারা কম প্রভাবিত হয়, এবং উচ্চ নির্ভুলতা এবং প্রজননযোগ্যতার সাথে পিসিআর প্রতিক্রিয়া প্রতিরোধকদের সহনশীলতা উন্নত হয়।

উচ্চ সংবেদনশীলতা এবং উচ্চ নির্ভুলতার বৈশিষ্ট্যের কারণে, এটি পিসিআর প্রতিক্রিয়া প্রতিরোধক দ্বারা সহজে হস্তক্ষেপ করা হয় না, এবং এটি আদর্শ পণ্য ছাড়াই প্রকৃত পরম পরিমাণ নির্ধারণ করতে পারে, যা একটি গবেষণা এবং অ্যাপ্লিকেশন হটস্পট হয়ে উঠেছে।

প্রতিক্রিয়া ইউনিটের বিভিন্ন রূপ অনুসারে, এটিকে তিনটি প্রধান প্রকারে ভাগ করা যায়: মাইক্রোফ্লুইডিক, চিপ এবং ড্রপলেট সিস্টেম।

1) মাইক্রোফ্লুইডিক ডিজিটাল পিসিআর, এমডিপিসিআর:

মাইক্রোফ্লুইডিক প্রযুক্তির উপর ভিত্তি করে, ডিএনএ টেমপ্লেট আলাদা করা হয়।মাইক্রোফ্লুইডিক প্রযুক্তি নমুনা ন্যানো-আপগ্রেডিং বা ছোট ফোঁটা তৈরি করতে পারে, তবে ফোঁটাগুলির একটি বিশেষ শোষণ পদ্ধতির প্রয়োজন হয় এবং তারপরে পিসিআর প্রতিক্রিয়া সিস্টেমের সাথে মিলিত হয়।mdPCR ধীরে ধীরে অন্যান্য পদ্ধতি দ্বারা প্রতিস্থাপন করা হয়েছে.

2) ফোঁটা-ভিত্তিক ডিজিটাল পিসিআর, ডিডিপিসিআর:

নমুনাকে ফোঁটায় প্রক্রিয়া করতে জল-মধ্য-তেল ফোঁটা তৈরির প্রযুক্তি ব্যবহার করুন এবং নিউক্লিক অ্যাসিড অণু ধারণকারী প্রতিক্রিয়া ব্যবস্থাকে হাজার হাজার ন্যানোস্কেল ড্রপলেটে ভাগ করুন, যার প্রতিটিতে সনাক্ত করা নিউক্লিক অ্যাসিড লক্ষ্য অণু থাকে না, বা পরীক্ষা করার জন্য এক থেকে একাধিক নিউক্লিক অ্যাসিড লক্ষ্য অণু থাকে।

3) চিপ-ভিত্তিক ডিজিটাল পিসিআর, সিডিপিসিআর:

সিলিকন ওয়েফার বা কোয়ার্টজ গ্লাসে অনেকগুলি মাইক্রোটিউব এবং মাইক্রোক্যাভিটি খোদাই করতে ইন্টিগ্রেটেড ফ্লুইড পাথওয়ে প্রযুক্তি ব্যবহার করুন এবং বিভিন্ন কন্ট্রোল ভালভের মাধ্যমে দ্রবণের প্রবাহ নিয়ন্ত্রণ করুন, এবং পরম পরিমাণ নির্ধারণের জন্য ডিজিটাল পিসিআর প্রতিক্রিয়ার জন্য প্রতিক্রিয়া কূপে নমুনা তরলকে একই আকারের ন্যানোমিটারে ভাগ করুন।

তৃতীয় প্রজন্মের পিসিআর এর প্রধান অসুবিধা:

সরঞ্জাম এবং বিকারক ব্যয়বহুল.

টেমপ্লেট মানের প্রয়োজনীয়তা উচ্চ.যদি টেমপ্লেটের পরিমাণ মাইক্রোসিস্টেমের পরিমাণকে ছাড়িয়ে যায়, তবে এটি পরিমাপ করা অসম্ভব হবে, এবং যদি এটি খুব ছোট হয়, তাহলে পরিমাণ নির্ভুলতা হ্রাস পাবে।

যখন অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন থাকে তখন মিথ্যা ইতিবাচকও উৎপন্ন হতে পারে।