• ফেসবুক
  • লিঙ্কডইন
  • ইউটিউব

পাইপেটের টিপস এবং ইপি টিউব ইত্যাদির জীবাণুমুক্তকরণ।

1. ডিওনাইজড জল দিয়ে 0.1% (এক হাজারতম) DEPC (অত্যন্ত বিষাক্ত পদার্থ) প্রস্তুত করুন, এটিকে একটি ফিউম হুডে সাবধানে ব্যবহার করুন এবং এটিকে আলো থেকে 4°C দূরে সংরক্ষণ করুন;

DEPC জল হল বিশুদ্ধ জল যা DEPC দিয়ে চিকিত্সা করা হয় এবং উচ্চ তাপমাত্রা এবং উচ্চ চাপ দ্বারা জীবাণুমুক্ত করা হয়।RNase, DNase এবং প্রোটিনেস মুক্ত হওয়ার জন্য পরীক্ষা করা হয়েছে।

2. পাইপেটের ডগা এবং EP টিউব 0.1% DEPC-তে রাখুন এবং নিশ্চিত করুন যে পিপেটের ডগা এবং EP টিউব 0.1% DEP দিয়ে পূর্ণ হয়েছে।

3. আলো থেকে রক্ষা করুন, দাঁড়াতে দিন, রাতারাতি (12-24 ঘন্টা)

4. টিপ এবং EP টিউব ধারণকারী বাক্সটি DEPC-তে ভিজানোর প্রয়োজন নেই।ডগা বা ইপি টিউবে DEPC জল মোটামুটিভাবে অপসারণ করার পরে, এটি প্যাক আপ করুন এবং এটি মোড়ানো।

5. 121 ডিগ্রি সেলসিয়াস, 30 মিনিট

6. 180 ডিগ্রি সেলসিয়াস, কয়েক ঘন্টার জন্য শুকনো (কমপক্ষে 3 ঘন্টা)

দ্রষ্টব্য: ক.DEPC পরিচালনা করার সময় ল্যাটেক্স গ্লাভস এবং মাস্ক পরুন!b, অথবা DEPC নির্বীজন ছাড়া, 130 ℃, 90min অটোক্লেভ (অনেক পরীক্ষাগারে উচ্চ তাপমাত্রায় দুইবার জীবাণুমুক্তকরণ)

আরএনএ নিষ্কাশন বিবেচনা

টিস্যু আরএনএ বিচ্ছিন্নতা ব্যর্থতার দুটি প্রধান ঘটনা

আরএনএ অবক্ষয় এবং টিস্যুতে অমেধ্যের অবশিষ্টাংশ,অবক্ষয় সম্পর্কে, আসুন প্রথমে দেখা যাক কেন সংস্কৃত কোষ থেকে আহরিত আরএনএ সহজে ক্ষয় হয় না।বিদ্যমান আরএনএ নিষ্কাশন বিকারকগুলির মধ্যে সমস্ত উপাদান রয়েছে যা দ্রুত RNaseকে বাধা দেয়।সংষ্কৃত কোষে লাইসেট যোগ করুন, এবং সহজভাবে এটি মিশ্রিত করুন, সমস্ত কোষ লাইসেটের সাথে পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে মিশ্রিত করা যেতে পারে এবং কোষগুলি সম্পূর্ণরূপে লাইসেট হয়ে যায়।কোষগুলি লাইজড হওয়ার পরে, লাইসেটের সক্রিয় উপাদানগুলি অবিলম্বে অন্তঃকোষীয় RNase কে বাধা দেয়, তাই RNA অক্ষত থাকে।অর্থাৎ, যেহেতু সংস্কৃত কোষগুলি সহজে এবং সম্পূর্ণরূপে লাইসেটের সাথে যোগাযোগ করে, তাদের আরএনএ সহজে ক্ষয় হয় না;অন্যদিকে, টিস্যুর আরএনএ সহজেই ক্ষয়প্রাপ্ত হয় কারণ টিস্যুর কোষগুলি লাইসেটের সাথে দ্রুত যোগাযোগ করতে পারে না।পর্যাপ্ত যোগাযোগের কারণে।তাই,আরএনএ ক্রিয়াকলাপকে বাধা দেওয়ার সময় টিস্যুকে একক কোষে পরিণত করার উপায় রয়েছে বলে ধরে নিলে, অবক্ষয়ের সমস্যাটি সম্পূর্ণভাবে সমাধান করা যেতে পারে।

তরল নাইট্রোজেন মিলিং এই ধরনের সবচেয়ে কার্যকর পদ্ধতি।যাইহোক, তরল নাইট্রোজেন মিলিং পদ্ধতি খুব ঝামেলাপূর্ণ, বিশেষ করে যখন নমুনার সংখ্যা বেশি।এটি পরবর্তী সেরা জিনিসের জন্ম দিয়েছে: হোমোজেনাইজার।দ্যহোমোজেনাইজারপদ্ধতিটি লাইসেটের সাথে কোষের যোগাযোগের আগে কীভাবে RNase কার্যকলাপকে বাধা দেয় সেই প্রশ্নটি বিবেচনা করে না, বরং প্রার্থনা করে যে টিস্যু বিঘ্নিত হওয়ার হার অন্তঃকোষীয় RNase RN কে যে হারে হ্রাস করে তার চেয়ে দ্রুত হয়।

বৈদ্যুতিক হোমোজেনাইজারের প্রভাব ভাল,এবং গ্লাস হোমোজেনাইজারের প্রভাব খারাপ, কিন্তু সাধারণভাবে, হোমোজেনাইজার পদ্ধতি অবনতির ঘটনাকে প্রতিরোধ করতে পারে না।অতএব, নিষ্কাশনের অবনতি হলে, তরল নাইট্রোজেন দিয়ে পিষানোর জন্য আসল বৈদ্যুতিক হোমোজেনাইজার ব্যবহার করা উচিত;আসল কাচের হোমোজেনাইজারটিকে বৈদ্যুতিক হোমোজেনাইজারে পরিবর্তন করতে হবে বা সরাসরি তরল নাইট্রোজেন দিয়ে মিলিত করতে হবে।সমস্যাটি প্রায় 100% সম্ভব।সমাধান করা

পরবর্তী পরীক্ষা-নিরীক্ষাকে প্রভাবিত করে অপরিষ্কার অবশিষ্টাংশের সমস্যাটির অবনতির চেয়ে আরও বৈচিত্র্যময় কারণ রয়েছে এবং সমাধানগুলিও একইভাবে ভিন্ন।উপসংহারে,যদি টিস্যুতে অবক্ষয় বা অবশিষ্ট অমেধ্য থাকে, তবে নির্দিষ্ট পরীক্ষামূলক উপাদানের জন্য নিষ্কাশন পদ্ধতি/বিকারক অবশ্যই অপ্টিমাইজ করা উচিত।অপ্টিমাইজেশানের জন্য আপনাকে আপনার মূল্যবান নমুনাগুলি ব্যবহার করতে হবে না: আপনি বাজার থেকে মাছ/মুরগির মতো কিছু ছোট প্রাণী কিনতে পারেন, আরএনএ নিষ্কাশনের জন্য উপাদানটির অনুরূপ অংশ নিতে পারেন, এবং অন্য অংশটি প্রোটিন নিষ্কাশনের জন্য - মুখ, পেট এবং অন্ত্রের নির্যাস দিয়ে পিষতে পারেন।

নিষ্কাশিত RNA এর লক্ষ্য RNA বিভিন্ন ফলো-আপ পরীক্ষার জন্য ব্যবহৃত হয় এবং এর মানের প্রয়োজনীয়তা ভিন্ন

সিডিএনএ লাইব্রেরি নির্মাণের জন্য এনজাইম প্রতিক্রিয়া প্রতিরোধকগুলির অবশিষ্টাংশ ছাড়াই আরএনএ অখণ্ডতা প্রয়োজন;উত্তরের জন্য উচ্চতর আরএনএ অখণ্ডতা এবং এনজাইম প্রতিক্রিয়া প্রতিরোধক অবশিষ্টাংশের জন্য নিম্ন প্রয়োজনীয়তা প্রয়োজন;RT-PCR-এর জন্য খুব বেশি RNA অখণ্ডতার প্রয়োজন হয় না,কিন্তু এনজাইম বিক্রিয়াকে বাধা দেয়।অবশিষ্টাংশ প্রয়োজনীয়তা কঠোর.ইনপুট আউটপুট নির্ধারণ করে;প্রতিবার লক্ষ্য সর্বোচ্চ বিশুদ্ধতা আরএনএ প্রাপ্ত করা হয়, এটা মানুষ এবং অর্থ খরচ হবে.

নমুনা সংগ্রহ/সঞ্চয়স্থান

অবক্ষয়কে প্রভাবিত করার কারণগুলি নমুনা জীবিত দেহ/বা মূল বৃদ্ধির পরিবেশ ছেড়ে চলে যাওয়ার পরে, নমুনার অন্তঃসত্ত্বা এনজাইমগুলি আরএনএকে হ্রাস করতে শুরু করবে,এবং অবক্ষয়ের হার অন্তঃসত্ত্বা এনজাইম এবং তাপমাত্রার বিষয়বস্তুর সাথে সম্পর্কিত।ঐতিহ্যগতভাবে, অন্তঃসত্ত্বা এনজাইমের কার্যকলাপকে সম্পূর্ণরূপে বাধা দেওয়ার জন্য শুধুমাত্র দুটি উপায় রয়েছে: অবিলম্বে লাইসেট যোগ করুন এবং পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে এবং দ্রুত একজাত করুন;ছোট ছোট টুকরো করে কেটে নিন এবং অবিলম্বে তরল নাইট্রোজেনে হিমায়িত করুন।উভয় পন্থা দ্রুত অপারেশন প্রয়োজন.পরবর্তীটি সমস্ত নমুনার জন্য উপযুক্ত, যখন আগেরটি কেবলমাত্র কোষ এবং অন্তঃসত্ত্বা এনজাইমগুলির কম উপাদানযুক্ত টিস্যুগুলির জন্য উপযুক্ত এবং একজাতকরণ করা সহজ।বিশেষ করে, গাছের টিস্যু, লিভার, থাইমাস, অগ্ন্যাশয়, প্লীহা, মস্তিষ্ক, চর্বি, পেশী টিস্যু ইত্যাদি অগ্রসর হওয়ার আগে তরল নাইট্রোজেন দিয়ে হিমায়িত করা হয়।

ফ্র্যাগমেন্টেশন এবং নমুনা একজাতকরণ

অবক্ষয় এবং ফলনের নমুনা বিভক্তকরণকে প্রভাবিতকারী উপাদানগুলিপুঙ্খানুপুঙ্খ একজাতকরণের জন্য, যা RNA এর সম্পূর্ণ এবং সম্পূর্ণ মুক্তির জন্য।কোষ ভাঙ্গা না হয়ে সরাসরি সমজাতীয় করা যেতে পারে।টিস্যুগুলি ভাঙার পরেই একজাতীয় হতে পারে।খামির এবং ব্যাকটেরিয়াকে সমজাতীয় করার আগে সংশ্লিষ্ট এনজাইম দিয়ে ভাঙতে হবে।নিম্ন অন্তঃসত্ত্বা এনজাইম উপাদান এবং সহজ সমজাতীয়করণ সহ টিস্যুগুলিকে এক সময়ে লাইসেটে একটি হোমোজেনাইজার দ্বারা চূর্ণ এবং একজাত করা যেতে পারে;উদ্ভিদ টিস্যু, যকৃত, থাইমাস, অগ্ন্যাশয়, প্লীহা, মস্তিষ্ক, চর্বি, পেশী টিস্যু এবং অন্যান্য নমুনা, এগুলি হয় অন্তঃসত্ত্বা এনজাইমগুলিতে বেশি বা সহজে একজাত হয় না,তাই টিস্যু ব্যাহত এবং সমজাতীয়করণ পৃথকভাবে সঞ্চালিত করা আবশ্যক.ফ্র্যাগমেন্টেশনের সবচেয়ে নির্ভরযোগ্য এবং সবচেয়ে উত্পাদনশীল পদ্ধতি হল তরল নাইট্রোজেন দিয়ে মিলিং করা এবং একজাতকরণের সবচেয়ে নির্ভরযোগ্য পদ্ধতি হল বৈদ্যুতিক হোমোজেনাইজার ব্যবহার।তরল নাইট্রোজেনের সাথে মিলিং সম্পর্কে একটি বিশেষ নোট: সম্পূর্ণ মিলিং প্রক্রিয়ার সময় নমুনাটি গলানো উচিত নয়, কারণ হিমায়িত হলে অন্তঃসত্ত্বা এনজাইমগুলি কাজ করার সম্ভাবনা বেশি থাকে।

লাইসেটের পছন্দ

অপারেশনের সুবিধা এবং অবশিষ্ট অন্তঃসত্ত্বা অমেধ্যের কারণগুলিকে প্রভাবিত করে সাধারণত ব্যবহৃত লাইসিস সমাধানগুলি প্রায় RNase-এর কার্যকলাপকে বাধা দিতে পারে।অতএব, লাইসিস সমাধান বেছে নেওয়ার মূল বিষয় হল পরিশোধন পদ্ধতির সাথে একত্রে বিবেচনা করা।একটি ব্যতিক্রম আছে:উচ্চ অন্তঃসত্ত্বা এনজাইম সামগ্রী সহ নমুনাগুলিতে অন্তঃসত্ত্বা এনজাইমগুলি নিষ্ক্রিয় করার ক্ষমতা বাড়ানোর জন্য ফেনলযুক্ত লাইসেট ব্যবহার করার পরামর্শ দেওয়া হয়।

পরিশোধন পদ্ধতির পছন্দ

যে উপাদানগুলি অবশিষ্টাংশের অন্তঃসত্ত্বা অমেধ্যকে প্রভাবিত করে, নিষ্কাশনের গতি কোষের মতো পরিষ্কার নমুনার জন্য, সন্তোষজনক ফলাফল হাতে থাকা প্রায় যেকোনো পরিশোধন পদ্ধতির মাধ্যমে পাওয়া যেতে পারে।কিন্তু অন্যান্য অনেক নমুনার জন্য, বিশেষ করে উচ্চমাত্রার অমেধ্য যেমন গাছপালা, লিভার, ব্যাকটেরিয়া ইত্যাদির জন্য, একটি উপযুক্ত পরিশোধন পদ্ধতি বেছে নেওয়া অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ।কলাম সেন্ট্রিফিউগাল বিশুদ্ধকরণ পদ্ধতির দ্রুত নিষ্কাশন গতি রয়েছে এবং এটি কার্যকরভাবে অমেধ্য অপসারণ করতে পারে যা RNA-এর পরবর্তী এনজাইমেটিক প্রতিক্রিয়াকে প্রভাবিত করে, তবে এটি ব্যয়বহুল (ফোরজিন সাশ্রয়ী কিট অফার করতে পারে, আরও বিস্তারিত ক্লিক করুনএখানে);লাভজনক এবং ক্লাসিক পরিশোধন পদ্ধতি ব্যবহার করে, যেমন LiCl বৃষ্টিপাত, এছাড়াও সন্তোষজনক ফলাফল পেতে পারে, কিন্তু অপারেশন সময় দীর্ঘ।.

আরএনএ নিষ্কাশনের জন্য "তিনটি শৃঙ্খলা এবং আটটি মনোযোগ"

শৃঙ্খলা 1:এক্সোজেনাস এনজাইমগুলির দূষণের অবসান ঘটান।

নোট 1:কঠোরভাবে মাস্ক এবং গ্লাভস পরুন।

নোট 2:সেন্ট্রিফিউজ টিউব, টিপ হেড, পাইপেট রড, ইলেক্ট্রোফোরেসিস ট্যাঙ্ক এবং পরীক্ষামূলক বেঞ্চগুলি পরীক্ষায় জড়িত পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে নিষ্পত্তি করা উচিত।

নোট 3:পরীক্ষার সাথে জড়িত বিকারক/সমাধান, বিশেষ করে জল, অবশ্যই RNase-মুক্ত হতে হবে।

শৃঙ্খলা 2:অন্তঃসত্ত্বা এনজাইমগুলির কার্যকলাপকে অবরুদ্ধ করে

নোট 4:একটি উপযুক্ত সমজাতকরণ পদ্ধতি চয়ন করুন।

নোট 5:একটি উপযুক্ত lysate চয়ন করুন.

নোট 6:নমুনার শুরুর পরিমাণ নিয়ন্ত্রণ করুন।

শৃঙ্খলা 3:আপনার নিষ্কাশন উদ্দেশ্য স্পষ্ট করুন

নোট 7:যেকোন লাইসেট সিস্টেম নমুনার সর্বাধিক প্রারম্ভিক পরিমাণের কাছাকাছি আসার সাথে সাথে, নিষ্কাশন সাফল্যের হার দ্রুত হ্রাস পায়।

নোট 8:সফল RNA নিষ্কাশনের একমাত্র অর্থনৈতিক মাপকাঠি হল পরবর্তী পরীক্ষায় সাফল্য, ফলন নয়।

RNase দূষণের শীর্ষ 10 উত্স

1. আঙ্গুলগুলি হল বহির্মুখী এনজাইমের প্রথম উৎস, তাই গ্লাভস অবশ্যই পরতে হবে এবং ঘন ঘন প্রতিস্থাপন করতে হবে।এছাড়াও, মাস্কও পরতে হবে, কারণ শ্বাস-প্রশ্বাসও এনজাইমের একটি গুরুত্বপূর্ণ উৎস।একটি গ্লাভ মাস্ক পরার একটি অতিরিক্ত সুবিধা হল পরীক্ষাকারীকে রক্ষা করা।

2. পিপেট টিপস, সেন্ট্রিফিউজ টিউব, পাইপেট - শুধুমাত্র নির্বীজন দ্বারা RNase নিষ্ক্রিয় করা যায় না, তাই পিপেটের টিপস এবং সেন্ট্রিফিউজ টিউবগুলিকে DEPC দিয়ে চিকিত্সা করা উচিত, এমনকি যদি সেগুলিকে DEPC হিসাবে চিহ্নিত করা হয়।একটি বিশেষ-উদ্দেশ্য পাইপেট ব্যবহার করা ভাল, ব্যবহারের আগে 75% অ্যালকোহল তুলোর বল দিয়ে মুছুন, বিশেষ করে রড;উপরন্তু, একটি মাথা রিমুভার ব্যবহার না নিশ্চিত করুন.

3. জল/বাফার অবশ্যই RNase দূষণমুক্ত হতে হবে।

4. কমপক্ষে 75% অ্যালকোহলযুক্ত তুলোর বল দিয়ে পরীক্ষার টেবিলটি পরিষ্কার করা উচিত।

5.Endogenous RNase সকল টিস্যুতে অন্তঃসত্ত্বা এনজাইম থাকে, তাই তরল নাইট্রোজেন দিয়ে টিস্যুকে দ্রুত হিমায়িত করাই অবক্ষয় কমানোর সর্বোত্তম উপায়।তরল নাইট্রোজেন স্টোরেজ/গ্রাইন্ডিং পদ্ধতি আসলেই অসুবিধাজনক, কিন্তু উচ্চ মাত্রার অন্তঃসত্ত্বা এনজাইম সহ টিস্যুগুলির জন্য এটিই একমাত্র উপায়।

6. RNA নমুনা RNA নিষ্কাশন পণ্যগুলিতে RNase দূষণের চিহ্ন থাকতে পারে।

7. প্লাজমিড নিষ্কাশন প্লাজমিড নিষ্কাশন প্রায়ই RNA হ্রাস করতে Rnase ব্যবহার করে, এবং অবশিষ্ট Rnase প্রোটিনেজ কে দিয়ে হজম করা উচিত এবং PCI দ্বারা নিষ্কাশন করা উচিত।

8. RNA স্টোরেজ কম তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হলেও, RNase-এর ট্রেস পরিমাণ RNA ক্ষয় ঘটাবে।RNA দীর্ঘমেয়াদী সংরক্ষণের জন্য সর্বোত্তম সমাধান হল লবণ/অ্যালকোহল সাসপেনশন, কারণ অ্যালকোহল নিম্ন তাপমাত্রায় সমস্ত এনজাইমেটিক কার্যকলাপকে বাধা দেয়।

9. যখন cations (Ca, Mg) এই আয়নগুলি ধারণ করে, 80C তাপমাত্রায় 5 মিনিটের জন্য গরম করার ফলে RNA ক্লিভ হয়ে যাবে, তাই RNA যদি গরম করার প্রয়োজন হয়, সংরক্ষণ দ্রবণে একটি চেলেটিং এজেন্ট (1mM সোডিয়াম সাইট্রেট, pH 6.4) থাকতে হবে।

10. পরবর্তী পরীক্ষায় ব্যবহৃত এনজাইম RNase দ্বারা দূষিত হতে পারে।

RNA নিষ্কাশন জন্য 10 টিপস

1: দ্রুত RNase কার্যকলাপ প্রতিরোধ করুন।সংগ্রহের পরে নমুনাগুলি দ্রুত হিমায়িত হয় এবং লাইসিসের সময় দ্রুত অপারেশনের মাধ্যমে RNase নিষ্ক্রিয় হয়ে যায়।

2: উচ্চ রাইবোজাইম কন্টেন্ট সহ টিস্যুগুলির জন্য একটি উপযুক্ত নিষ্কাশন পদ্ধতি চয়ন করুন এবং অ্যাডিপোজ টিস্যু ফেনল ধারণকারী পদ্ধতি ব্যবহার করা ভাল।

3: ভবিষ্যদ্বাণী গুণমান উত্তরের প্রয়োজন, cDNA লাইব্রেরি নির্মাণের জন্য উচ্চ অখণ্ডতা প্রয়োজন, এবং RT-PCR এবং RPA (Ribonuclease সুরক্ষা অ্যাস) উচ্চ অখণ্ডতার প্রয়োজন হয় না।RT-PCR-এর জন্য উচ্চ বিশুদ্ধতা প্রয়োজন (এনজাইম ইনহিবিটর অবশিষ্টাংশ)।

4: পুঙ্খানুপুঙ্খ সমজাতকরণ হল ফলন উন্নত করার এবং অবক্ষয় কমানোর চাবিকাঠি।

5: RNA ইলেক্ট্রোফোরেসিস সনাক্তকরণের অখণ্ডতা পরীক্ষা করুন, 28S: 18S = 2: 1 একটি সম্পূর্ণ চিহ্ন, 1: 1 বেশিরভাগ পরীক্ষার জন্যও গ্রহণযোগ্য।

6: RT-PCR, অ্যারে বিশ্লেষণের জন্য DNA অপসারণ DNA অপসারণের জন্য Dnase I ব্যবহার করা ভাল।

7: বহিরাগত এনজাইমগুলির দূষণ হ্রাস করুন - এনজাইমগুলি বাইরে থেকে আমদানি করা যাবে না।

8: কম ঘনত্বের নিউক্লিক অ্যাসিড ঘনীভূত করার সময়, একটি সহ-বর্ষণ বিকারক যোগ করা উচিত।কিন্তু এনজাইম এবং ডিএনএ দূষণ ধারণকারী কো-প্রিসিপিট্যান্ট প্রতিরোধ করতে।

9: পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে RNA দ্রবীভূত করুন, প্রয়োজনে, 5 মিনিটের জন্য 65C তাপমাত্রায় তাপ করুন।

উপযুক্ত স্টোরেজ পদ্ধতি

এটি অল্প সময়ের জন্য -20C এবং দীর্ঘ সময়ের জন্য -80C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা যেতে পারে।RNA ফলন উন্নত করার প্রথম ধাপ হল বুঝতে হবে যে বিভিন্ন নমুনার RNA বিষয়বস্তু ব্যাপকভাবে পরিবর্তিত হয়।উচ্চ প্রাচুর্য (2-4ug/mg) যেমন লিভার, প্যানক্রিয়াস, হার্ট, মাঝারি প্রাচুর্য (0.05-2ug/mg) যেমন মস্তিষ্ক, ভ্রূণ, কিডনি, ফুসফুস, থাইমাস, ডিম্বাশয়, কম প্রাচুর্য (<0.05ug/mg) mg) যেমন মূত্রাশয়, হাড়, চর্বি।

1: RN মুক্ত করতে লাইজ কোষ - যদি আরএনএ প্রকাশ না করা হয় তবে ফলন হ্রাস পাবে।বৈদ্যুতিক সমজাতকরণ অন্যান্য সমজাতকরণ পদ্ধতির চেয়ে ভাল কাজ করে, তবে অন্যান্য পদ্ধতির সাথেও মিলিত হতে পারে, যেমন তরল নাইট্রোজেন ম্যাশিং, এনজাইমেটিক হজম (লাইসোজাইম/লাইটিকেস)

2: নিষ্কাশন পদ্ধতির অপ্টিমাইজেশান।ফেনল-ভিত্তিক পদ্ধতিগুলির সাথে সবচেয়ে বড় সমস্যা হল অসম্পূর্ণ স্তরবিন্যাস এবং আংশিক আরএনএ ক্ষতি (সুপারনেট্যান্ট সম্পূর্ণরূপে অপসারণ করা যায় না)।অসম্পূর্ণ স্তরবিন্যাস উচ্চ নিউক্লিক অ্যাসিড এবং প্রোটিন সামগ্রীর কারণে, যা ব্যবহৃত লাইসেটের পরিমাণ বাড়িয়ে বা নমুনার পরিমাণ হ্রাস করে সমাধান করা যেতে পারে।অ্যাডিপোজ টিস্যুতে ক্লোরোফর্ম নিষ্কাশনের একটি ধাপ যুক্ত করা হয়েছিল।ব্যাক-পাম্পিং বা সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা অনুসরণ করা জৈব স্তর অপসারণের মাধ্যমে আরএনএ ক্ষতি হ্রাস করা যেতে পারে।কলাম সেন্ট্রিফিউগেশন-ভিত্তিক পদ্ধতির সবচেয়ে বড় সমস্যা হল অতিরিক্ত নমুনা।

ক্লাসিক নিষ্কাশন টিপস

1. ফেনল পরিশোধন: 1:1 ফিনল/ক্লোরোফর্মের সমান পরিমাণ যোগ করুন এবং 1-2 মিনিটের জন্য জোরে মিশ্রিত করুন।2 মিনিটের জন্য উচ্চ গতিতে সেন্ট্রিফিউজ করুন।সাবধানে সুপারনাট্যান্ট (80-90%) অপসারণ করুন।কখনো মধ্যম স্তরে যাবেন না।ফিনল/ক্লোরোফর্মে প্রতিক্রিয়া দ্রবণের সমান আয়তন যোগ করা যেতে পারে এবং সুপারনাট্যান্ট অপসারণ করা যেতে পারে।ফলন উন্নত করার জন্য নিউক্লিক অ্যাসিড বৃষ্টিপাতের জন্য দুটি সুপারনাট্যান্ট একসাথে মিশ্রিত করা যেতে পারে।মিশ্রিত করার সময় খুব মৃদু হবেন না এবং সমস্ত সুপারনাট্যান্ট অপসারণের চেষ্টা করবেন না।

2. 70-80% ইথানল দিয়ে ধোয়া: ধোয়ার সময়, অবশিষ্ট লবণ যাতে ধুয়ে যায় তা নিশ্চিত করতে নিউক্লিক অ্যাসিড অবশ্যই সাসপেন্ড করতে হবে।একই সময়ে, ইথানল ঢালার পরপরই, কয়েক সেকেন্ডের জন্য উচ্চ গতিতে সেন্ট্রিফিউজ করুন এবং তারপরে একটি পিপেট দিয়ে অবশিষ্ট ইথানলটি সরান।5-10 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় দাঁড়ানোর পরে দ্রবীভূত করুন।

11. বিশেষ সংস্থার নিষ্কাশন

1. তন্তুযুক্ত টিস্যু: হৃদপিণ্ড/কঙ্কালের পেশীর মতো তন্তুযুক্ত টিস্যু থেকে আরএনএ নিষ্কাশনের চাবিকাঠি হল টিস্যুকে সম্পূর্ণরূপে ব্যাহত করা।এই টিস্যুগুলির কোষের ঘনত্ব কম থাকে, তাই টিস্যুর প্রতি ইউনিট ওজনে RNA-এর পরিমাণ কম, এবং যতটা সম্ভব প্রারম্ভিক পরিমাণ ব্যবহার করা ভাল।হিমায়িত অবস্থায় টিস্যুটি পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে পিষে নিতে ভুলবেন না।

2. উচ্চ প্রোটিন/চর্বিযুক্ত টিস্যু: মস্তিষ্ক/উদ্ভিজ্জ চর্বি পরিমাণ বেশি।পিসিআই নিষ্কাশনের পরে, সুপারনাট্যান্টে সাদা ফ্লোকুলস থাকে।ক্লোরোফর্ম দিয়ে সুপারনেট্যান্টকে আবার বের করতে হবে।

3. উচ্চ নিউক্লিক অ্যাসিড/রাইবোজাইম সামগ্রী সহ টিস্যু: প্লীহা/থাইমাসে উচ্চ নিউক্লিক অ্যাসিড এবং রাইবোজাইম উপাদান রয়েছে।হিমায়িত অবস্থায় টিস্যু নাকাল এবং দ্রুত একজাতকরণ কার্যকরভাবে রাইবোজাইম নিষ্ক্রিয় করতে পারে।যাইহোক, যদি লাইসেট খুব সান্দ্র হয় (উচ্চ নিউক্লিক অ্যাসিড সামগ্রীর কারণে), PCI নিষ্কাশন কার্যকরভাবে স্তরিত করতে সক্ষম হবে না;আরো lysate যোগ এই সমস্যা সমাধান করতে পারেন.একাধিক PCI নিষ্কাশন আরও অবশিষ্ট ডিএনএ অপসারণ করতে পারে।অ্যালকোহল যোগ করার সাথে সাথে যদি একটি সাদা বর্ষণ হয় তবে এটি ডিএনএ দূষণ নির্দেশ করে।দ্রবীভূত হওয়ার পর অ্যাসিডিক পিসিআই দিয়ে পুনরায় নিষ্কাশন করলে ডিএনএ দূষণ দূর হয়।

4. উদ্ভিদ টিস্যু: উদ্ভিদের টিস্যু প্রাণীর টিস্যুর চেয়ে জটিল।সাধারণত, গাছপালা তরল নাইট্রোজেন অবস্থার অধীনে মাটিতে থাকে, তাই অন্তঃসত্ত্বা এনজাইম দ্বারা RNA ক্ষয় অস্বাভাবিক।যদি অবক্ষয় সমস্যা সমাধান না করা হয়, এটি প্রায় নিশ্চিতভাবে নমুনায় থাকা অমেধ্য দ্বারা সৃষ্ট হয়।অনেক উদ্ভিদের মধ্যে থাকা অমেধ্যগুলি অবশিষ্টাংশের দিকে পরিচালিত করবে, এবং প্রায়শই অবশিষ্টাংশের কারণ হল এই অমেধ্যগুলির আরএনএ-এর সাথে কিছু মিল রয়েছে: আপনি বর্ষণ করেন এবং আমি বর্ষণ করি এবং আপনি শোষণ করি এবং আমি শোষণ করি।এই বৈশিষ্ট্যগুলি নির্ধারণ করে যে তারা খুব শক্তিশালী এনজাইম ইনহিবিটার।

বর্তমানে, বাণিজ্যিক RNA নিষ্কাশন বিকারকগুলি ছোট সমন্বয়ের সাথে প্রায় সমস্ত প্রাণীর টিস্যুতে অভিযোজিত হতে পারে, তবে কিছু বাণিজ্যিক RNA নিষ্কাশন বিকারক রয়েছে যা বেশিরভাগ উদ্ভিদের টিস্যুর জন্য উপযুক্ত হতে পারে।সৌভাগ্যবশত, Foregene বিশেষ প্রদান করতে পারেনউদ্ভিদ আরএনএ নিষ্কাশন কিট, আমাদের আছেউদ্ভিদ মোট RNA বিচ্ছিন্নতা কিট, প্ল্যান্ট টোটাল আরএনএ আইসোলেশন কিট প্লাস.পরেরটি বিশেষভাবে উচ্চ পলিস্যাকারাইড এবং পলিফেনল সামগ্রী সহ উদ্ভিদের জন্য ডিজাইন করা হয়েছে।RNA নিষ্কাশনের জন্য, ল্যাব ব্যবহারকারীদের কাছ থেকে প্রতিক্রিয়া বিশেষভাবে ভাল।

12. নমুনা হিমায়িত এবং গলানোর প্রভাব হিমায়িত নমুনা বড় হতে পারে, এবং এটি RNA নিষ্কাশনের জন্য ব্যবহার করার আগে কাটা প্রয়োজন।কাটার সময় নমুনাগুলি গলে যায় (সম্ভবত আংশিকভাবে)।আরএনএ নিষ্কাশনের আগে হিমায়িত নমুনাগুলি ওজন করা প্রয়োজন হতে পারে এবং এই প্রক্রিয়ার সময় গলানো অবশ্যই ঘটবে।কখনও কখনও, তরল নাইট্রোজেন মিলিং প্রক্রিয়ার সময়ও নমুনা গলানো হয়;অথবা হিমায়িত নমুনা তরল নাইট্রোজেন মিলিং ছাড়াই সরাসরি লাইসেটে যোগ করা হয় এবং সম্পূর্ণ একজাতকরণের আগে গলানো অবশ্যই ঘটবে।পরীক্ষায় দেখা গেছে যে হিমায়িত টিস্যু তাজা টিস্যুর চেয়ে গলানোর সময় আরএনএ অবক্ষয়ের প্রবণতা বেশি।সম্ভাব্য কারণ: হিমায়িত-গলে যাওয়া প্রক্রিয়া কোষের মধ্যে গঠনগুলিকে ব্যাহত করে, যার ফলে অন্তঃসত্ত্বা এনজাইমগুলি আরএনএর সাথে সরাসরি সংস্পর্শে আসা সহজ করে তোলে।

13. RNA মানের বিচার সাধারণত, ইলেক্ট্রোফোরেসিস RNA এর অখণ্ডতা বিচার করতে ব্যবহৃত হয় এবং A260/A280 RNA এর বিশুদ্ধতা বিচার করতে ব্যবহৃত হয়।তাত্ত্বিকভাবে, অক্ষত RNA এর অনুপাত 28S:18S = 2.7:1, এবং বেশিরভাগ ডেটা 28S:18S = 2:1 অনুপাতকে জোর দেয়।আসল বিষয়টি হল যে কোষ ব্যতীত অন্য নমুনা থেকে বের করা RNA এর প্রায় কোনটিই 2:1 অনুপাতে নেই (এটি Agilent Bioanalyzer ব্যবহার করে প্রাপ্ত হয়েছিল)।

RNA-এর ইলেক্ট্রোফোরেসিস ফলাফলগুলি গৌণ কাঠামো, ইলেক্ট্রোফোরেসিস অবস্থা, নমুনা লোড, EB দ্বারা স্যাচুরেশন ডিগ্রি ইত্যাদি সহ অনেকগুলি কারণ দ্বারা প্রভাবিত হয়। আরএনএ সনাক্ত করতে স্থানীয় ইলেক্ট্রোফোরেসিস ব্যবহার করুন এবং নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ডিএনএ মার্কার ব্যবহার করুন।যদি 2kb-এ 28S এবং 0.9kb-এ 18S স্পষ্ট হয়, এবং 28S: 18S > 1, অখণ্ডতা পরবর্তী অধিকাংশ পরীক্ষার প্রয়োজনীয়তা পূরণ করতে পারে।

A260/A280 হল একটি সূচক যা অনেক বিভ্রান্তির সৃষ্টি করেছে।প্রথমত, নিউক্লিক অ্যাসিডের জন্য এই সূচকটির আসল অর্থটি স্পষ্ট করা প্রয়োজন: বিশুদ্ধ আরএনএ, এর A260/280 = প্রায় 2.0।বিশুদ্ধ RNA হল 'কারণ' এবং A260/A280 = 2 হল 'প্রভাব'।এখন সবাই A260/A280 কে 'কারণ' হিসেবে ব্যবহার করছে, এই ভেবে যে "যদি A260/A280 = 2 হয়, তাহলে RNA খাঁটি", যা স্বাভাবিকভাবেই বিভ্রান্তির দিকে নিয়ে যায়।

আপনি যদি আগ্রহী হন, আপনি আপনার RNA নমুনায় একটি সামান্য বিকারক যোগ করতে পারেন যা প্রায়শই নিষ্কাশনে ব্যবহৃত হয়, যেমন ফেনল, গুয়ানিডিন আইসোথিওসায়ানেট, পিইজি ইত্যাদি, এবং তারপরে A260/A280 অনুপাত পরিমাপ করতে পারেন।বাস্তবতা হল RNA নিষ্কাশনের জন্য ব্যবহৃত অনেক রিএজেন্ট, সেইসাথে নমুনার অনেক অমেধ্য, A260 এবং A280 এর আশেপাশে শোষণ করে, A260/A280 কে প্রভাবিত করে।

বর্তমানে সবচেয়ে শিক্ষামূলক পদ্ধতি হল 200-300 nm পরিসরে RNA নমুনা স্ক্যান করা।বিশুদ্ধ RNA এর বক্ররেখার নিম্নলিখিত বৈশিষ্ট্য রয়েছে: বক্ররেখাটি মসৃণ, A230 এবং A260 দুটি প্রবর্তন বিন্দু, A300 হল 0 এর কাছাকাছি, A260/A280 = 2.0 এর কাছাকাছি, এবং A260/A230 = 2.0 এর কাছাকাছি।স্ক্যান ডেটা উপলব্ধ না হলে, A260/A230 অনুপাতও অবশ্যই নির্ধারণ করতে হবে, কারণ এই অনুপাতটি এনজাইমেটিক প্রতিক্রিয়াকে প্রভাবিত করে এমন সমস্ত অমেধ্য বহনের জন্য আরও সংবেদনশীল।ডিভাইসের রৈখিক পরিসীমা বিবেচনা করুন (A260 এর জন্য 0.1-0.5)।

আরও দুটি দরকারী ঘটনা রয়েছে: A260/A280 যখন জলে পরিমাপ করা হয় তখন অনুপাতটি প্রায় 0.3 কম হবে;যখন 10 mM EDTA তে পরিমাপ করা অনুপাত 1 mM EDTA-তে পরিমাপ করা হয়েছে তার থেকে প্রায় 0.2 বেশি।

সংশ্লিষ্ট পণ্য:

চায়না প্ল্যান্ট টোটাল আরএনএ আইসোলেশন কিট প্রস্তুতকারক এবং সরবরাহকারী |Foregene (foreivd.com)

RNA বিচ্ছিন্নতা সিরিজ সরবরাহকারী এবং কারখানা |চায়না আরএনএ আইসোলেশন সিরিজ ম্যানুফ্যাকচারার্স (foreivd.com)

আরএনএ আইসোলেশন সিরিজ – ফোরজিন কোং লিমিটেড (foreivd.com)


পোস্টের সময়: জুলাই-15-2022