পরীক্ষাগারে একটি নতুন হিসাবে, কম রূপান্তর হার সহ একগুচ্ছ উদ্ভিদ থেকে ইতিবাচক গাছগুলি স্ক্রিন করা ভাল কাজ নয়।প্রথমত, একের পর এক বিপুল সংখ্যক নমুনা থেকে ডিএনএ বের করতে হবে এবং তারপরে পিসিআর দ্বারা বিদেশী জিনগুলি সনাক্ত করা হবে।যাইহোক, ফলাফলগুলি প্রায়শই ফাঁকা এবং মাঝে মাঝে কয়েকটি আইটেম সহ ব্যান্ড থাকে, তবে মিস সনাক্তকরণ বা মিথ্যা সনাক্তকরণ রয়েছে কিনা তা নির্ধারণ করা অসম্ভব।.এই ধরনের পরীক্ষামূলক প্রক্রিয়া এবং ফলাফলের মুখোমুখি হওয়া কি খুব অসহায়?চিন্তা করবেন না, ভাই আপনাকে শেখায় কিভাবে সহজে এবং নির্ভুলভাবে ট্রান্সজেনিক পজিটিভ গাছপালা স্ক্রিন করা যায়।

ধাপ 1

ডিজাইন সনাক্তকরণ প্রাইমার

পরীক্ষা করা নমুনা অনুযায়ী অন্তঃসত্ত্বা জিন এবং বহির্মুখী জিন নির্ণয় করুন এবং প্রাইমার ডিজাইনের জন্য জিনে একটি প্রতিনিধি 100-500bp ক্রম নির্বাচন করুন।ভাল প্রাইমারগুলি সনাক্তকরণের ফলাফলের নির্ভুলতা নিশ্চিত করতে পারে এবং সনাক্তকরণের সময়কে ছোট করতে পারে (সাধারণত ব্যবহৃত সনাক্তকরণ প্রাইমারগুলির জন্য পরিশিষ্ট দেখুন)।

দ্রষ্টব্য: নতুন ডিজাইন করা প্রাইমারগুলিকে প্রতিক্রিয়া শর্তগুলি অপ্টিমাইজ করতে হবে এবং বড় আকারের সনাক্তকরণের আগে সনাক্তকরণের নির্ভুলতা, নির্ভুলতা এবং সনাক্তকরণ সীমা যাচাই করতে হবে।

ধাপ ২

পরীক্ষামূলক প্রোটোকল ডিজাইন করুন

ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ: পিসিআর প্রতিক্রিয়া সিস্টেম এবং অবস্থা স্বাভাবিক কিনা তা নির্ধারণ করতে একটি টেমপ্লেট হিসাবে লক্ষ্য টুকরা ধারণকারী বিশুদ্ধ ডিএনএ ব্যবহার করুন।

নেতিবাচক/খালি নিয়ন্ত্রণ: পিসিআর সিস্টেমে দূষণের উত্স আছে কিনা তা সনাক্ত করতে একটি টেমপ্লেট হিসাবে লক্ষ্য টুকরা ধারণ করে না এমন DNA টেমপ্লেট বা ddH2O ব্যবহার করুন।

অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স নিয়ন্ত্রণ: নমুনার অন্তঃসত্ত্বা জিনের প্রাইমার/প্রোব সংমিশ্রণটি ব্যবহার করুন যাতে PCR দ্বারা টেমপ্লেট সনাক্ত করা যায় কিনা তা মূল্যায়ন করতে পরীক্ষা করা হয়।

বিজ্ঞপ্তি:

পরীক্ষামূলক ফলাফলের বৈধতা মূল্যায়ন করার জন্য প্রতিটি পরীক্ষার জন্য ইতিবাচক, নেতিবাচক/শূন্য নিয়ন্ত্রণ এবং অভ্যন্তরীণ নিয়ন্ত্রণ নিয়ন্ত্রণ সেট করা উচিত।

পরীক্ষার প্রস্তুতি

ব্যবহারের আগে, সমাধানটি সমানভাবে মিশ্রিত কিনা তা পর্যবেক্ষণ করুন।যদি বৃষ্টিপাত পাওয়া যায়, এটি ব্যবহারের আগে নির্দেশাবলী অনুযায়ী দ্রবীভূত এবং মিশ্রিত করা প্রয়োজন।2×PCR মিক্সকে অমসৃণ আয়ন বিতরণ এড়াতে ব্যবহারের আগে একটি মাইক্রোপিপেটের সাথে বারবার পাইপেটেড এবং মিশ্রিত করতে হবে।

বিজ্ঞপ্তি:

ম্যানুয়ালটি বের করে নিন এবং সাবধানে পড়ুন এবং ম্যানুয়ালটির প্রয়োজনীয়তা অনুযায়ী কঠোরভাবে পরীক্ষার আগে প্রস্তুতি নিন।

ধাপ 4

পিসিআর প্রতিক্রিয়া সিস্টেম প্রস্তুত করুন

পরীক্ষামূলক প্রোটোকল অনুসারে, প্রাইমার, H2O এবং 2×PCR মিশ্রিত করুন সমানভাবে, সেন্ট্রিফিউজ করুন এবং প্রতিটি প্রতিক্রিয়া টিউবে বিতরণ করুন।

বিজ্ঞপ্তি:

বড় আকারের বা দীর্ঘমেয়াদী পরীক্ষার জন্য, এটি UNG এনজাইম ধারণকারী একটি PCR প্রতিক্রিয়া সিস্টেম ব্যবহার করার সুপারিশ করা হয়, যা কার্যকরভাবে পিসিআর পণ্য দ্বারা সৃষ্ট অ্যারোসল দূষণ এড়াতে পারে।

ধাপ 5

প্রতিক্রিয়া টেমপ্লেট যোগ করুন

সরাসরি পিসিআর প্রযুক্তি ব্যবহার করে, ক্লান্তিকর নিউক্লিক অ্যাসিড পরিশোধন প্রক্রিয়ার প্রয়োজন নেই, নমুনা টেমপ্লেটটি 10 ​​মিনিটের মধ্যে প্রস্তুত করা যেতে পারে এবং সংশ্লিষ্ট পিসিআর প্রতিক্রিয়া সিস্টেম যোগ করা যেতে পারে।

বিজ্ঞপ্তি:

ক্লিভেজ পদ্ধতিতে আরও ভাল সনাক্তকরণ প্রভাব রয়েছে এবং প্রাপ্ত পণ্যটি একাধিক সনাক্তকরণ প্রতিক্রিয়ার জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে।

5.1: পাতার সরাসরি সম্প্রসারণ

ম্যানুয়ালটিতে ছবির আকার অনুযায়ী, 2-3 মিমি ব্যাস সহ পাতার টিস্যু কেটে পিসিআর প্রতিক্রিয়া পদ্ধতিতে রাখুন।

দ্রষ্টব্য: নিশ্চিত করুন যে পাতার টুকরোগুলি পিসিআর প্রতিক্রিয়া দ্রবণে সম্পূর্ণরূপে নিমজ্জিত হয়েছে, এবং অতিরিক্ত পাতার টিস্যু যোগ করবেন না।

5.2: পাতা বিভক্ত করার পদ্ধতি

5-7 মিমি ব্যাস সহ পাতার টিস্যু কেটে একটি সেন্ট্রিফিউজ টিউবে রাখুন।আপনি যদি পরিপক্ক পাতা বেছে নেন, তাহলে পাতার মূল শিরার টিস্যু ব্যবহার করা এড়িয়ে চলুন।পিপেট 50ul বাফার P1 লাইসেট একটি সেন্ট্রিফিউজ টিউবে লাইসেট নিশ্চিত করুন যে লাইসেটটি পাতার টিস্যুকে সম্পূর্ণরূপে নিমজ্জিত করতে পারে, এটি একটি থার্মাল সাইক্লার বা একটি ধাতব স্নানে রাখুন এবং 5-10 মিনিটের জন্য 95°C তাপমাত্রায় লাইসেট করুন৷

50ul Buffer P2 নিরপেক্ষ সমাধান যোগ করুন এবং ভালভাবে মেশান।ফলস্বরূপ লাইসেট একটি টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে এবং পিসিআর প্রতিক্রিয়া সিস্টেমে যোগ করা যেতে পারে।

দ্রষ্টব্য: টেমপ্লেটের পরিমাণ PCR সিস্টেমের 5-10% এর মধ্যে, এবং 20% এর বেশি হওয়া উচিত নয় (উদাহরণস্বরূপ, একটি 20μl PCR সিস্টেমে, 1-2μl lysis সমাধান যোগ করুন, 4μl এর বেশি নয়)।

ধাপ 6

পিসিআর প্রতিক্রিয়া

পিসিআর প্রতিক্রিয়া টিউবকে কেন্দ্রীভূত করার পরে, এটি প্রশস্তকরণের জন্য একটি পিসিআর যন্ত্রে স্থাপন করা হয়।

বিজ্ঞপ্তি:

বিক্রিয়াটি পরিবর্ধনের জন্য অ-বিশুদ্ধ টেমপ্লেট ব্যবহার করে, তাই বিশুদ্ধ ডিএনএ টেমপ্লেট ব্যবহার করার তুলনায় পরিবর্ধন চক্রের সংখ্যা 5-10 বেশি চক্র।

ধাপ 7

ইলেক্ট্রোফোরসিস সনাক্তকরণ এবং ফলাফল বিশ্লেষণ

M: 100bp DNA মই

1\4: বিশুদ্ধ ডিএনএ পদ্ধতি

2\5: সরাসরি PCR পদ্ধতি

3\6: ফাঁকা নিয়ন্ত্রণ

QC:

পরীক্ষায় সেট করা বিভিন্ন নিয়ন্ত্রণের পরীক্ষার ফলাফল নিম্নলিখিত শর্তগুলি পূরণ করতে হবে।অন্যথায়, সমস্যার কারণ বিশ্লেষণ করা উচিত এবং সমস্যাটি নির্মূল হওয়ার পরে আবার পরীক্ষা করা উচিত।

সারণি 1. বিভিন্ন নিয়ন্ত্রণ গ্রুপের সাধারণ পরীক্ষার ফলাফল

*যখন প্লাজমিডকে ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহার করা হয়, তখন অন্তঃসত্ত্বা জিন পরীক্ষার ফলাফল নেতিবাচক হতে পারে

ফলাফলের রায়:

উ: নমুনার অন্তঃসত্ত্বা জিনের পরীক্ষার ফলাফল নেতিবাচক, যা নির্দেশ করে যে সাধারণ পিসিআর সনাক্তকরণের জন্য উপযুক্ত ডিএনএ নমুনা থেকে বের করা যায় না বা নিষ্কাশিত ডিএনএ-তে পিসিআর প্রতিক্রিয়া প্রতিরোধক রয়েছে এবং ডিএনএ আবার বের করা উচিত।

B. নমুনার এন্ডোজেনাস জিনের পরীক্ষার ফলাফল ইতিবাচক, এবং বহিরাগত জিনের পরীক্ষার ফলাফল নেতিবাচক, যা নির্দেশ করে যে সাধারণ PCR সনাক্তকরণের জন্য উপযুক্ত DNA নমুনা থেকে বের করা হয়েছে, এবং এটি বিচার করা যেতে পারে যে নমুনায় XXX জিন সনাক্ত করা হয়নি।

C. নমুনার এন্ডোজেনাস জিনের পরীক্ষার ফলাফল ইতিবাচক, এবং বহিরাগত জিনের পরীক্ষার ফলাফল ইতিবাচক, যা নির্দেশ করে যে সাধারণ PCR সনাক্তকরণের জন্য উপযুক্ত DNA নমুনা থেকে বের করা হয়েছে, এবং নমুনা DNA-এ XXX জিন রয়েছে।নিশ্চিতকরণ পরীক্ষাগুলি আরও বাহিত হতে পারে।

ধাপ 8

ডিজাইন সনাক্তকরণ প্রাইমার

পরীক্ষার পরে, পরিবেশ দূষণ রোধ করতে পরীক্ষামূলক এলাকা মুছে ফেলার জন্য 2% সোডিয়াম হাইপোক্লোরাইট দ্রবণ এবং 70% ইথানল দ্রবণ ব্যবহার করুন।