COVID-19 হল একটি সংক্রামক রোগ যা সিভিয়ার অ্যাকিউট রেসপিরেটরি সিনড্রোম করোনাভাইরাস টাইপ 2 দ্বারা সৃষ্ট। যখন একজন ব্যক্তি সংক্রামিত হয়, তখন সবচেয়ে সাধারণ লক্ষণগুলির মধ্যে রয়েছে জ্বর, কাশি এবং শ্বাসকষ্ট।

পরীক্ষার জন্য ব্যবহৃত নমুনাগুলি নাসোফ্যারিঞ্জিয়াল সোয়াব বা অরোফ্যারিঞ্জিয়াল সোয়াব দ্বারা সংগ্রহ করা যেতে পারে।

পিসিআর কি?

করোনাভাইরাস সনাক্তকরণের আদর্শ পদ্ধতি হল পলিমারেজ চেইন প্রতিক্রিয়া, পিসিআর।এটি আণবিক জীববিজ্ঞানে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত একটি পদ্ধতি।এটি দ্রুত লক্ষ লক্ষ থেকে বিলিয়ন নির্দিষ্ট ডিএনএ টুকরা কপি করতে পারে।

নতুন করোনভাইরাসটিতে একটি খুব দীর্ঘ একক-স্ট্র্যান্ডেড আরএনএ জিনোম রয়েছে।পিসিআর দ্বারা এই ভাইরাসগুলি সনাক্ত করার জন্য, আরএনএ অণুগুলিকে তাদের পরিপূরক ডিএনএ সিকোয়েন্সে বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজের মাধ্যমে রূপান্তর করতে হবে এবং তারপরে নতুন সংশ্লেষিত ডিএনএকে স্ট্যান্ডার্ড পিসিআর পদ্ধতির দ্বারা প্রশস্ত করা যেতে পারে, যা সাধারণত RT-PCR নামে পরিচিত।

RT-PCR প্রক্রিয়া

আরএনএ নিষ্কাশন

এই পদ্ধতি সঞ্চালনের জন্য, ভাইরাল আরএনএ মূলত নিষ্কাশন করা উচিত।সুবিধাজনক, দ্রুত এবং কার্যকর বিচ্ছেদের জন্য বিভিন্ন ধরনের RNA পরিশোধন কিট ব্যবহার করা যেতে পারে।

একটি বাণিজ্যিক কিট ব্যবহার করে ভাইরাল আরএনএ বের করতে, প্রথমে একটি মাইক্রোসেন্ট্রিফিউজ টিউবে নমুনা যোগ করুন এবং তারপর এটি লাইসিস বাফারের সাথে মিশ্রিত করুন।এই বাফারটি অত্যন্ত বিকৃত এবং সাধারণত ফেনল এবং গুয়ানিডিন আইসোথিওসায়ানেট নিয়ে গঠিত।উপরন্তু, RNase ইনহিবিটরগুলি সাধারণত অক্ষত ভাইরাল RNA এর বিচ্ছিন্নতা নিশ্চিত করতে লাইসিস বাফারে উপস্থিত থাকে।

লাইসিস বাফার যোগ করার পর, নাড়ি দিয়ে মিক্সিং টিউব ঘূর্ণি করুন এবং ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করুন।ভাইরাসটি তখন লাইসিস বাফার দ্বারা প্রদত্ত অত্যন্ত বিকৃত অবস্থার অধীনে লাইসিস করা হয়।

নমুনাটি লাইজ করার পরে, পরিশোধন পদ্ধতির জন্য একটি সেন্ট্রিফিউজ টিউব ব্যবহার করা হয়।নমুনাটি সেন্ট্রিফিউজ টিউবে লোড করা হয় এবং তারপর সেন্ট্রিফিউজ করা হয়।

এই পদ্ধতিটি একটি কঠিন ফেজ নিষ্কাশন পদ্ধতি যেখানে স্থির পর্যায়ে একটি সিলিকা জেল ম্যাট্রিক্স থাকে।

সর্বোত্তম লবণ এবং পিএইচ অবস্থার অধীনে, আরএনএ অণুগুলি সিলিকা ঝিল্লির সাথে আবদ্ধ হয়।

একই সময়ে, প্রোটিন এবং অন্যান্য দূষক অপসারণ করা হয়।

সেন্ট্রিফিউগেশনের পরে, সেন্ট্রিফিউজ টিউবটিকে একটি পরিষ্কার সংগ্রহের টিউবে রাখুন, ফিল্ট্রেটটি বাতিল করুন এবং তারপরে ওয়াশিং বাফার যোগ করুন।

ঝিল্লি মাধ্যমে ধোয়া বাফার জোর করে সেন্ট্রিফিউজে টিউব আবার রাখুন।এটি ঝিল্লি থেকে সমস্ত অবশিষ্ট অমেধ্য অপসারণ করবে, শুধুমাত্র আরএনএ সিলিকা জেলের সাথে আবদ্ধ থাকবে।

নমুনাটি ধুয়ে ফেলার পরে, টিউবটিকে একটি পরিষ্কার মাইক্রোসেন্ট্রিফিউজ টিউবে রাখুন এবং ইলুশন বাফার যোগ করুন।

তারপর ঝিল্লির মাধ্যমে ইলুশন বাফারকে জোর করে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়।ইলিউশন বাফার স্পিন কলাম থেকে ভাইরাল আরএনএ অপসারণ করে এবং প্রোটিন, ইনহিবিটর এবং অন্যান্য দূষকমুক্ত বিশুদ্ধ আরএনএ পায়।

ধাপ ২

মিশ্র ঘনত্ব

ভাইরাল আরএনএ বের করার পর, পরবর্তী ধাপ হল পিসিআর পরিবর্ধনের জন্য প্রতিক্রিয়া মিশ্রণ প্রস্তুত করা।এই ধাপে, মনোনিবেশ ব্যবহার করা হয়।এই ঘনীভূত দ্রবণ হল একটি প্রিমিক্সযুক্ত ঘনীভূত দ্রবণ যাতে একটি প্রিমিক্স, রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ, নিউক্লিওটাইডস, ফরোয়ার্ড প্রাইমার, রিভার্স প্রাইমার, টাকম্যান প্রোব এবং ডিএনএ পলিমারেজ থাকে।

অবশেষে, এই বিক্রিয়া মিশ্রণ সম্পূর্ণ করতে, RNA টেমপ্লেট যোগ করা হয়।টিউবগুলি পালস ঘূর্ণি দ্বারা মিশ্রিত হয় এবং তারপরে প্রতিক্রিয়া মিশ্রণটি পিসিআর প্লেটে লোড করা হয়।পিসিআর প্লেটে সাধারণত 96টি কূপ থাকে এবং একই সময়ে একাধিক নমুনা বিশ্লেষণ করতে পারে।

ধাপ 3

পিসিআর পরিবর্ধন

এর পরে, প্লেটটি পিসিআর মেশিনে রাখুন, যা মূলত একটি তাপীয় চক্র।

রিয়েল-টাইম RT-PCR RdrRP জিন, ই জিন এবং এন জিনে লক্ষ্য ক্রম বিবর্ধিত করে 2019 নভেল করোনাভাইরাস সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়।লক্ষ্য জিনের পছন্দ প্রাইমার এবং প্রোবের ক্রম উপর নির্ভর করে।

RT-PCR-এর প্রথম ধাপ হল বিপরীত প্রতিলিপি।পরিপূরক ডিএনএর প্রথম স্ট্র্যান্ডটি সংশ্লেষিত হয়, যা পিসিআর রিভার্স প্রাইমার দ্বারা শুরু হয়, যা ভাইরাল আরএনএ জিনোমের পরিপূরক অংশের সাথে আবদ্ধ হয়।তারপর রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ ভাইরাল আরএনএর পরিপূরক ডিএনএ সংশ্লেষণ করতে প্রাইমারের 3′প্রান্তে DNA নিউক্লিওটাইড যোগ করে।এই ধাপের তাপমাত্রা এবং সময়কাল প্রাইমার, টার্গেট আরএনএ এবং ব্যবহৃত বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজের উপর নির্ভর করে।

এর পরে, একটি প্রাথমিক বিকৃতকরণ পদক্ষেপ প্রয়োগ করা হয়, যার ফলে RNA-DNA হাইব্রিডের বিকৃতি ঘটে।ডিএনএ পলিমারেজ সক্রিয় করার জন্য এই পদক্ষেপটি প্রয়োজনীয়।একই সময়ে, বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্টেজ নিষ্ক্রিয় করা হয়।

PCR তাপচক্রের একটি সিরিজ নিয়ে গঠিত।প্রতিটি চক্র বিকৃতকরণ, অ্যানিলিং এবং এক্সটেনশন পদক্ষেপ নিয়ে গঠিত।

ডিনাচুরেশন ধাপে প্রতিক্রিয়া চেম্বারকে 95 ডিগ্রি সেলসিয়াসে গরম করা এবং ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ টেমপ্লেটের বিকৃতকরণের জন্য এটি ব্যবহার করা জড়িত।

পরবর্তী ধাপে, প্রতিক্রিয়ার তাপমাত্রা 58 ডিগ্রি সেলসিয়াসে কমিয়ে আনা হয়, যা ফরোয়ার্ড প্রাইমারটিকে তার একক-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ টেমপ্লেটের পরিপূরক অংশে অ্যানিল করার অনুমতি দেয়।অ্যানিলিং তাপমাত্রা সরাসরি প্রাইমারের দৈর্ঘ্য এবং রচনার উপর নির্ভর করে।

এক্সটেনশন ধাপে, ডিএনএ পলিমারেজ একটি নতুন ডিএনএ স্ট্র্যান্ড সংশ্লেষণ করে যা ডিএনএ টেমপ্লেট স্ট্র্যান্ডের পরিপূরক।বিক্রিয়া মিশ্রণ থেকে 5′থেকে 3′দিকের টেমপ্লেটে মুক্ত নিউক্লিয়াস পরিপূরক যোগ করে।এই ধাপের তাপমাত্রা নির্ভর করে ব্যবহৃত ডিএনএ পলিমারেজের উপর।

প্রথম চক্রের পরে, একটি ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ লক্ষ্য প্রাপ্ত হয়।

তারপরে, দ্বিতীয় চক্রে প্রবেশ করুন।ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ দুটি একক-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ অণু তৈরি করতে বিকৃত করা হয়।

পরবর্তী ধাপে, প্রতিক্রিয়ার তাপমাত্রা কমানো হয়, প্রাইমারগুলিকে প্রতিটি একক-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ টেমপ্লেটে অ্যানিল করা হয়, এবং টাক-ম্যান প্রোবকে লক্ষ্য ডিএনএর পরিপূরক অংশে অ্যানিল করা হয়।

TaqMan প্রোব একটি ফ্লুরোফোর সমন্বিতভাবে অলিগোনিউক্লিওটাইড প্রোবের 5′প্রান্তের সাথে যুক্ত থাকে।সাইক্লারের আলোর উত্স দ্বারা উত্তেজিত হলে, ফ্লুরোফোর ফ্লুরোসেন্স নির্গত করে।উপরন্তু, প্রোব 3′প্রান্তে একটি quencher গঠিত হয়.প্রতিবেদক জিনের নৈকট্য নিবারকের সাথে ফ্লুরোসেন্স সনাক্তকরণে বাধা দেয়।

এক্সটেনশন ধাপে, ডিএনএ পলিমারেজ একটি নতুন স্ট্র্যান্ড সংশ্লেষিত করে।পলিমারেজ যখন TaqMan প্রোবের কাছে পৌঁছায়, তখন এর অন্তঃসত্ত্বা 5′নিউক্লিজ ক্রিয়াকলাপ প্রোবটিকে ক্লিভ করে, রঞ্জকটিকে নিভেনকারী থেকে আলাদা করে।

পিসিআর-এর প্রতিটি চক্রের সাথে, আরও রঞ্জক অণু নির্গত হয়, যার ফলে সংশ্লেষিত অ্যামপ্লিকন সংখ্যার সমানুপাতিক ফ্লুরোসেন্স তীব্রতা বৃদ্ধি পায়।

এই পদ্ধতিটি নমুনায় উপস্থিত একটি প্রদত্ত অনুক্রমের সংখ্যা অনুমান করতে দেয়।ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ খণ্ডের সংখ্যা প্রতিটি চক্রে দ্বিগুণ হয়।অতএব, PCR খুব ছোট নমুনা বিশ্লেষণ করতে ব্যবহার করা যেতে পারে।

ফ্লুরোসেন্ট সিগন্যাল পরিমাপের জন্য, টাংস্টেন হ্যালোজেন বাতি, উত্তেজনা ফিল্টার, প্রতিফলক, লেন্স, নির্গমন ফিল্টার এবং চার্জ কাপলড ডিভাইস-ব্যবহার সিসিডি ক্যামেরা।

ধাপ 4 সনাক্ত করুন

ফ্লুরোসেন্ট সিগন্যাল পরিমাপের জন্য, টাংস্টেন হ্যালোজেন বাতি, উত্তেজনা ফিল্টার, প্রতিফলক, লেন্স, নির্গমন ফিল্টার এবং চার্জ কাপলড ডিভাইস-ব্যবহার সিসিডি ক্যামেরা।

বাতি থেকে ফিল্টার করা আলো প্রতিফলক দ্বারা প্রতিফলিত হয়, কনডেনসার লেন্সের মধ্য দিয়ে যায় এবং প্রতিটি গর্তের কেন্দ্রে ফোকাস করা হয়।তারপর গর্ত থেকে নির্গত ফ্লুরোসেন্স আয়না থেকে প্রতিফলিত হয়, নির্গমন ফিল্টারের মধ্য দিয়ে যায় এবং সিসিডি ক্যামেরা দ্বারা সনাক্ত করা হয়।প্রতিটি পিসিআর চক্রে, স্ব-উত্তেজিত ফ্লুরোফোর আলো সিসিডি দ্বারা সনাক্ত করা যেতে পারে।

এটি ক্যাপচার করা আলোকে ডিজিটাল ডেটাতে রূপান্তর করে।এই পদ্ধতিটিকে রিয়েল-টাইম পিসিআর বলা হয় এবং এটি পিসিআর প্রতিক্রিয়ার অগ্রগতির রিয়েল-টাইম পর্যবেক্ষণের অনুমতি দেয়।