পিসিআর রিএজেন্টের প্রাথমিক পর্যায়ে প্রাইমার এবং প্রোবের কার্যকারিতা যাচাই করা এবং সবচেয়ে উপযুক্ত প্রতিক্রিয়া শর্তগুলি নির্ধারণ করা হল আনুষ্ঠানিক পরীক্ষাগুলির মসৃণ অগ্রগতি নিশ্চিত করার পূর্বশর্ত।
তাহলে কিভাবে আমরা প্রাথমিক পর্যায়ে প্রাইমার প্রোব নিশ্চিত করতে হবে?
প্রধান সূচকগুলি হল বেসলাইন, পরিবর্ধন বক্ররেখা, CT মান, পরিবর্ধন দক্ষতা, কম ঘনত্বের নমুনা সনাক্তকরণ, সিভি ইত্যাদি।
বেসলাইন
বেসলাইন হল পিসিআর পরিবর্ধন বক্ররেখার অনুভূমিক রেখা।পিসিআর পরিবর্ধন প্রতিক্রিয়ার প্রথম কয়েকটি চক্রে, ফ্লুরোসেন্স সংকেত খুব বেশি পরিবর্তিত হয় না এবং একটি সরল রেখা তৈরি করে।এই সরলরেখা হল বেসলাইন।
PCR প্রাইমার প্রোব স্ক্রীনিং করার সময়, বেসলাইন লেভেল কিনা সেদিকে মনোযোগ দিন।প্রাইমার প্রোবের ঘনত্বের বিশুদ্ধতা বেসলাইনকে প্রভাবিত করবে, যেমন বেসলাইন উপরে উঠতে বা পড়ে যায়।বেসলাইনটিও একটি খুব স্বজ্ঞাত সূচক।
পরিবর্ধন বক্ররেখা
আরেকটি স্বজ্ঞাত সূচক হল পরিবর্ধন বক্ররেখার আকৃতি।সেকেন্ডারি অ্যামপ্লিফিকেশন বা অন্যান্য অস্বাভাবিক অ্যামপ্লিফিকেশন কার্ভ এড়াতে এস-আকৃতির বক্ররেখা থাকা ভাল।
Ct মান
বেসলাইন থেকে সূচকীয় বৃদ্ধি পর্যন্ত প্রবর্তন বিন্দুর সাথে সম্পর্কিত চক্রের সংখ্যা হল Ct মান।
একই নমুনার জন্য, বিভিন্ন প্রাইমার প্রোবের ফলে বিভিন্ন পরিবর্ধন বক্ররেখা হয়, এবং সংশ্লিষ্ট Ct মান পরিবর্ধন দক্ষতা এবং হস্তক্ষেপ ডিগ্রী দ্বারা প্রভাবিত হবে।তাত্ত্বিকভাবে, প্রাইমার প্রোবের Ct মান যত ছোট হবে, তত ভালো।
পরিবর্ধন দক্ষতা
PCR পরিবর্ধন দক্ষতা মূল্যায়নের জন্য সবচেয়ে নির্ভরযোগ্য এবং স্থিতিশীল পদ্ধতিগুলির মধ্যে একটি হল আদর্শ বক্ররেখা, যা গবেষকরা ব্যাপকভাবে স্বীকৃত।পদ্ধতিটি লক্ষ্য টেমপ্লেটের আপেক্ষিক সংখ্যা নিয়ন্ত্রণ করতে নমুনার একটি সিরিজ তৈরি করে।এই নমুনাগুলি সাধারণত ঘনীভূত স্টক সলিউশনের সিরিয়াল পাতলা করে তৈরি করা হয়, সবচেয়ে বেশি ব্যবহৃত হয় 10-গুণ তরল।পাতলা নমুনার একটি সিরিজ ব্যবহার করে, Cq মান প্রাপ্ত করার জন্য প্রশস্ত করার জন্য স্ট্যান্ডার্ড qPCR প্রোগ্রাম ব্যবহার করে এবং অবশেষে প্রতিটি নমুনার ঘনত্ব এবং রৈখিক সমীকরণ Cq= -klgX0+b, এবং পরিবর্ধন দক্ষতা E=10(-1 /k1)-এর জন্য সংশ্লিষ্ট Cq মান অনুযায়ী একটি আদর্শ বক্ররেখা আঁকুন।পরিমাণগত বিশ্লেষণের জন্য qPCR ব্যবহার করার সময়, পরিবর্ধন দক্ষতা 90%-110% (3.6>k>3.1) এর মধ্যে থাকা প্রয়োজন।
কম ঘনত্বের নমুনা সনাক্তকরণ
যখন নমুনার ঘনত্ব কম হয়, তখন বিভিন্ন প্রাইমার প্রোবের সনাক্তকরণের হার ভিন্ন হয়।আমরা প্রতিলিপি করার জন্য 20টি কম ঘনত্বের নমুনা নির্বাচন করি এবং সর্বোচ্চ সনাক্তকরণ হার সহ প্রাইমার-প্রোব সিস্টেমটি সর্বোত্তম।
প্রকরণের সহগ (CV)
নিউক্লিক অ্যাসিড পরিবর্ধন সনাক্তকরণের জন্য বিকারকের লাইন স্ট্যান্ডার্ড অনুযায়ী বিভিন্ন প্রাইমার প্রোবের সাহায্যে 10টি সদৃশ নমুনা সনাক্ত করা যেতে পারে।
পরিমাণগত বিকারক:
সঠিকতা
একটি ব্যাচের মধ্যে নির্ভুলতা পূরণ করা উচিত: পরীক্ষার ঘনত্বের লগারিদমিক মানের বৈচিত্র্যের সহগ (CV,%) হল ≤5%।নমুনার ঘনত্ব কম হলে, সনাক্তকরণ ঘনত্বের লগারিদমের প্রকরণের সহগ (CV,%) হল ≤10%
গুণগত বিকারক:
সঠিকতা
এক ব্যাচের মধ্যে নির্ভুলতা পূরণ করা উচিত:
(1) Ct মানের পরিবর্তনের সহগ (CV,%) ≤5%
একই নমুনা 10 বার সমান্তরালভাবে পরীক্ষা করা হয় এবং পরীক্ষার ফলাফলগুলি সামঞ্জস্যপূর্ণ হওয়া উচিত
পোস্টের সময়: সেপ্টেম্বর-18-2021
